DNA测序技术

DNA测序技术（DNA sequencing technology）是分子生物学研究中用于确定DNA分子中核苷酸精确顺序的方法，是进一步研究和改造目的基因的基础。目前主流技术包括Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam & Gilbert（1977）发明的化学降解法。两者在原理上差异很大，但均基于在某一固定点开始，随机在特定碱基处终止，生成A、T、C、G四组不同长度的核苷酸片段，随后通过尿素变性PAGE胶电泳检测，从而获得DNA序列。

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• 测定未知序列
• 确定重组DNA的方向与结构
• 对突变进行定位和鉴定
• 比较研究

• 70年代末：Walter Gilbert发明化学法，Frederick Sanger发明双脱氧终止法手动测序，采用同位素标记。
• 80年代中期：出现自动测序仪（应用双脱氧终止法原理），荧光代替同位素，计算机图像识别。
• 90年代中期：测序仪重大改进，集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳。
• 2001年：完成人类基因组框架图。

化学修饰法测序原理

化学试剂处理末端DNA片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳分离。化学切割反应包括碱基的修饰，修饰的碱基从其糖环上转移出去，在失去碱基的糖环处DNA断裂。

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Sanger法测序的原理

利用DNA聚合酶延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP），并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3'-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

一、概述

Promega公司的SILVER SEQUENCE™ DNA测序系统是一种无引物，减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费，不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂，也不需要仪器来检测序列条带。 ADSFAEQWER353423413434

Taq DNA聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰产品，对于双链DNA模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP（7-deaza dGTP）或dITP替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。 ADFASDFAF23RQ23R

退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构，提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片段PCR产物（<500bp）得到清楚的序列数据的能力。应该使用尽可能高的退火温度，对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。大于24mer且GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。

由于本系统采用热循环装置，与常规测序方法相比具有如下好处： (1) 线性扩增模板DNA产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要0.03--2 pmol模板DNA。 (2) 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA模板的碱变性及乙醇沉淀过程，也有助于消除由于线性dsDNA模板快速重退火所引起的问题。 (3) 高温聚合酶反应减弱了DNA模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。 ADFASDFAF23RQ23R

待测已提纯的DNA，可为单链或双链。设备包括高压电泳仪、测序用电泳槽、制胶设备、PCR仪。试剂包括SILVER SEQUENCE™ DNA测序试剂盒、丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液、10%过硫酸铵、10×TBE缓冲液、TBE电极缓冲液、TEMED、固定/停止溶液（10%冰醋酸）、染色溶液（硝酸银2克、甲醛3ml，溶于2升超纯水）、显影溶液（60克碳酸钠溶于2升超纯水，使用前加3ml 37%甲醛和40ml硫代硫酸钠溶液（10mg/ml））、95%乙醇、0.5%冰乙酸、Sigmacote。 ADSFAEQWER353423413434

使用银染测序系统需注意：DNA的浓度和纯度必须经过琼脂糖凝胶电泳或荧光法测定；分光光度法可能高估DNA浓度；DNA制备过程中核糖核酸酶处理产生的核糖核苷酸会有260nm光吸收。

（一）测序反应

1. 标记四个0.5ml eppendorf管（G、A、T、C），每管加入2μl适当的d/ddNTP混合物，加矿物油。 2. 在eppendorf管中混合模板DNA、5×测序缓冲液、引物、无菌ddH₂O至16μl。 3. 加入1μl测序级Taq DNA聚合酶（5u/μl），混匀。 4. 吸取4μl加入每个d/ddNTP混合物管中。 5. 离心后放入热循环仪，选择最佳退火温度。 6. 循环程序完成后，每管加入3μl终止溶液。 ADFASDFAF23RQ23R

（二）测序凝胶板的制备

玻璃板需清洁处理，短玻璃板用粘合溶液处理，长玻璃板用Sigmacote处理。按所需浓度（一般6%-8%）配制凝胶，混匀后灌制胶板。 ADFASDFAF23RQ23R

（三）电泳

聚合完全后，插入鲨鱼齿梳形成加样孔。固定胶板后加入1×TBE缓冲液，按30V/cm预电泳20-30分钟。样品在沸水浴中加热1-3分钟，立即置于冰上。上样顺序一般为G、A、T、C。开始用30V/cm电泳，5分钟后提高至40-60V/cm，恒压状态。55cm长、0.2mm厚的凝胶板在2500V恒压下电泳2小时。

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（四）测序凝胶的银染

1. 电泳完毕后分开两板。 2. 固定凝胶：用固定/停止溶液浸没，振荡20分钟。 3. 洗胶：超纯水洗3次，每次2分钟。 4. 凝胶染色：染色溶液摇动30分钟。 5. 凝胶显影：在显影液中加入甲醛和硫代硫酸钠溶液，从染色溶液中取出凝胶浸洗5-10秒，立刻转移至预冷显影液振荡直至条带出现。 6. 固定凝胶：加入等体积固定/停止溶液。 7. 超纯水浸洗两次，每次2分钟。 8. 室温干燥或抽气加热干燥，在可见光灯箱上观察。

DNA测序技术自1977年Sanger和Gilbert的奠基性工作以来，经历了从手动到自动化、从同位素到非同位素标记的深刻变革。非同位素银染测序系统因其快速、廉价、无放射性的特点，特别适用于研究实验室。该技术仍在不断发展，随着高通量测序等新技术的出现，其应用前景更加广阔。 ADFASDFAF23RQ23R

• Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A. R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences, 74(12), 5463-5467.
• Maxam, A. M., & Gilbert, W. (1977). A new method for sequencing DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences, 74(2), 560-564.
• 张树庸. (2002). DNA测序技术的发展. 生物技术通报, (3), 1-4.
• 李志勇, 朱玉贤. (2006). DNA测序技术及其应用. 遗传, 28(11), 1463-1470.
• Shendure, J., & Ji, H. (2008). Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology, 26(10), 1135-1145.
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• 赵凯, 王玉. (2011). 高通量测序技术及其在医学研究中的应用. 医学分子生物学杂志, 8(1), 58-63.