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GUIDE-seq

GUIDE-seq(Genome-wide Unbiased Identification of DSBs Enabled by Sequencing)是一种用于检测CRISPR-Cas9介导的DNA双链断裂(DSBs)的方法。它通过结合Cas9介导的靶向基因组切割和DNA测序技术,能够高效地识别CRISPR-Cas9诱导的基因组编辑事件,包括脱靶效应和未预期的突变。


GUIDE-seq的工作原理如下:


1. **引入Cas9与gRNA复合物**:首先,在细胞中引入Cas9蛋白和与gRNA组合形成的Cas9-gRNA复合物。这个复合物会与目标DNA序列中的特定靶位点结合,导致DNA的双链断裂。


2. **引入双链断裂标签**:接着,在细胞中引入一种包含短序列标签的DNA片段。这些标签的序列与Cas9-gRNA复合物诱导的双链断裂位点相邻。


3. **标签与断裂位点连接**:当DNA双链断裂发生时,引入的DNA片段会与断裂位点连接。这使得在断裂位点周围形成了一段包含标签序列的DNA片段。


4. **文库构建和测序**:然后,通过文库构建和高通量测序技术,将这些包含标签序列的DNA片段进行放大和测序。


5. **数据分析**:最后,通过分析测序数据,可以确定断裂位点及其周围的序列。这使得可以识别CRISPR-Cas9介导的DNA双链断裂事件,并进一步研究脱靶效应和未预期的突变。


GUIDE-seq方法的优点包括高效、灵敏和全基因组范围的检测能力。它为研究人员提供了一种有效的工具,用于评估CRISPR-Cas9基因编辑技术的特异性和安全性,以及优化gRNA的设计和Cas9蛋白的选择。

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