GUIDE-seq

GUIDE-seq（Genome-wide Unbiased Identification of DSBs Enabled by Sequencing） 是一种高通量检测CRISPR-Cas系统在基因组中脱靶切割位点的技术，由麻省理工学院团队于2015年开发。其核心是通过双链寡核苷酸（dsODN）标记DNA双链断裂（DSB），实现全基因组范围内脱靶效应的无偏鉴定。以下从原理、流程、优势及优化方向深度解析：

一、技术原理

核心设计：dsODN捕获DSB

1. 标记机制：

   • 向细胞转染一段生物素化的双链寡核苷酸（dsODN）（典型序列：5ʹ-Biotin-TGCTCTGTAAACTTGGGTTG-3ʹ）。

   • 当CRISPR-Cas系统在基因组任意位置诱导DNA双链断裂（DSB） 时，细胞内的非同源末端连接（NHEJ） 修复途径会将dsODN插入断裂位点。

2. 富集与测序：

   • 通过链霉亲和素磁珠捕获所有含生物素标记的DNA片段。

   • 建库测序后，定位dsODN插入位点 → 直接反映Cas9的切割位置。

二、实验流程

关键步骤与试剂

注：dsODN需设计为钝端或粘端以匹配NHEJ修复机制（常用钝端）。

三、技术优势

1. 无偏性：

   • 不依赖预知的脱靶位点，可发现全新脱靶区域（区别于PCR扩增靶向检测法）。

2. 高灵敏度：

   • 可检测低频脱靶事件（灵敏度达0.1%以下）。

3. 直接标记DSB：

   • 比间接方法（如染色质免疫沉淀）更准确反映Cas9活性。

4. 广适用性：

   • 兼容多种CRISPR系统（Cas9、Cas12a）、碱基编辑器及锌指核酸酶（ZFN）。

四、局限性及优化策略

五、应用场景

1. CRISPR工具评估：

   • 比较不同gRNA的脱靶率（如20nt gRNA vs. 截短型gRNA）。

2. 新型编辑器优化：

   • 验证高保真Cas9变体（如HypaCas9、eSpCas9）的脱靶改善效果。

3. 临床安全性评估：

   • 用于基因治疗前筛选低脱靶gRNA（如CAR-T细胞编辑）。

六、数据分析流程

1. 原始数据处理：

   • 使用 GUIDE-seq分析软件包（Python/R）过滤低质量读段。

2. 插入位点定位：

   • 将测序读段比对到参考基因组（如hg38），识别dsODN插入位点。

3. 脱靶位点鉴定：

   • 统计每个位点的读取深度与插入频率，阈值设定（通常≥5个reads且高于背景10倍）。

4. 可视化输出：

   • 生成全基因组脱靶位点图谱（如Integrative Genomics Viewer展示）。

七、对比其他脱靶检测技术

八、总结与展望

GUIDE-seq作为金标准级脱靶检测技术，通过原位标记DSB实现了高灵敏度、无偏性的全基因组扫描。未来方向包括：

• 多重gRNA同步检测（如MAGeCK-GUIDE-seq）

• 单细胞分辨率分析（结合scATAC-seq技术）

• 体内应用拓展（优化dsODN递送载体）

引用：Tsai SQ, et al. Nat Biotechnol. 2015;33(2):187-197.
工具链接：GUIDE-seq分析代码