STED

STED（Stimulated Emission Depletion, 受激发射抑制显微镜）是一种超分辨率显微镜技术，通过抑制部分荧光分子的发射，提高成像分辨率。STED显微镜利用受激发射原理，使得发光区域仅限于纳米尺度，从而突破了光学显微镜的衍射极限，实现超高分辨率的成像。

**STED的工作原理**：

1. **荧光激发**：

   - 使用激发激光将荧光分子激发到激发态，使其发射荧光。

2. **受激发射抑制**：

   - 紧接着使用一个环形的STED激光脉冲，STED激光的波长调节为与荧光分子发射波长匹配，使处于激发态的荧光分子通过受激发射返回基态，从而抑制荧光发射。

   - 由于STED激光呈环形分布，只有中心区域的荧光分子未被抑制，这个区域的尺寸取决于STED激光的强度和波长。

3. **超分辨率成像**：

   - 通过扫描整个样品，逐点收集荧光信号，并将未被抑制的荧光点位置重建为高分辨率图像。由于仅有中心小区域的荧光分子能够发射荧光，这使得成像分辨率显著提高。

**STED显微镜的实验步骤**：

1. **样品制备**：

   - 将样品固定，并使用适当的荧光染料或荧光蛋白标记目标分子。这些染料应具有良好的光物理特性，能够在STED显微镜下有效发光和受激发射抑制。

2. **光学成像**：

   - 使用两个激光器，一个用于激发荧光分子，另一个用于受激发射抑制。激发激光和STED激光的时序和强度需要精确控制。

3. **数据采集和图像重建**：

   - 逐点扫描样品，收集荧光信号，并通过计算机软件重建高分辨率图像。

**STED的应用**：

1. **细胞生物学**：

   - 研究细胞骨架、细胞器和分子复合物的精细结构和分布，如微管、肌动蛋白、核孔复合物等。

2. **神经科学**：

   - 研究神经元突触、受体和信号通路的结构和功能，揭示神经网络的精细组织。

3. **分子生物学**：

   - 分析蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用，研究基因表达调控和信号传导机制。

4. **病理学**：

   - 研究疾病相关分子的定位和分布，揭示疾病发生的分子机制，如癌症、神经退行性疾病等。

**STED的优缺点**：

**优点**：

- **高分辨率**：STED能够达到20-30纳米的分辨率，显著高于传统光学显微镜。

- **实时成像**：STED可以实时成像活细胞中的分子动态，研究动态生物过程。

- **多色成像**：能够同时成像多种荧光分子，研究分子间的相互作用和共定位。

**缺点**：

- **复杂的样品制备**：需要特定的荧光染料和样品固定方法，制备过程较复杂。

- **高光强需求**：STED激光的高强度可能导致光毒性和荧光漂白，影响活细胞成像。

- **数据处理要求高**：成像数据需要复杂的计算和处理，需使用专门的软件和算法。

**STED的改进和发展方向**：

1. **优化荧光染料**：开发更稳定、高效的荧光染料，提高成像信噪比和分辨率。

2. **快速成像技术**：改进成像速度，减少活细胞成像时的光毒性和漂白效应。

3. **多色成像**：实现多种荧光分子的同时定位和成像，研究分子间的相互作用和共定位。

4. **自动化数据处理**：开发高效、自动化的数据处理软件，提高成像数据的处理和分析效率。

**参考文献**：

1. Hell SW, Wichmann J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 1994;19(11):780-782.

2. Klar TA, Jakobs S, Dyba M, Egner A, Hell SW. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(15):8206-8210.

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5. Harke B, Ullal CK, Keller J, Hell SW. Three-dimensional nanoscopy of colloidal crystals. Nano Lett. 2008;8(5):1309-1313.