PALM

PALM（Photoactivated Localization Microscopy，光活化定位显微镜）是一种超分辨率显微镜技术，通过光活化荧光分子并精确定位其位置，突破光学显微镜的衍射极限，实现纳米级分辨率的成像。PALM和STORM（随机光学重建显微镜）类似，都是基于单分子定位的超分辨率显微镜技术。

**PALM的工作原理**：

1. **光活化和成像**：

   - 使用光活化荧光蛋白或光转换荧光染料，通过激发光将少量荧光分子转换到发光状态。这些荧光分子在成像过程中随机闪烁。

2. **单分子定位**：

   - 在每一个成像帧中，只有少量的荧光分子发光，形成彼此分离的光斑。通过高斯拟合这些光斑的中心位置，可以精确定位单个荧光分子的坐标，达到纳米级的定位精度。

3. **多帧叠加重建**：

   - 多帧成像的单分子定位信息被叠加和重建，形成一个高分辨率的图像。这一过程重复进行，直到足够多的荧光分子被定位，最终生成的图像分辨率可达10-20纳米。

**PALM的实验步骤**：

1. **样品制备**：

   - 将目标样品固定，并使用光活化荧光蛋白（如PA-GFP、PA-mCherry、mEos2）或光转换荧光染料标记目标分子。

2. **光学成像**：

   - 使用激光激发荧光分子，调整激光强度和波长，以控制荧光分子的开关状态。通常使用低强度激发光和高强度转换光的组合来控制荧光分子的转换和发光。

3. **单分子定位**：

   - 收集多帧图像数据，每帧中只有少量荧光分子发光。使用计算机软件对每帧图像中的光斑进行高斯拟合，精确定位每个单分子的坐标。

4. **图像重建**：

   - 将多帧成像数据的单分子定位信息叠加，生成高分辨率的重建图像。

**PALM的应用**：

1. **细胞生物学**：

   - 研究细胞骨架、细胞器和分子复合物的精细结构和分布，如微管、肌动蛋白、核孔复合物等。

2. **神经科学**：

   - 研究神经元突触、受体和信号通路的结构和功能，揭示神经网络的精细组织。

3. **分子生物学**：

   - 分析蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用，研究基因表达调控和信号传导机制。

4. **病理学**：

   - 研究疾病相关分子的定位和分布，揭示疾病发生的分子机制，如癌症、神经退行性疾病等。

**PALM的优缺点**：

**优点**：

- **高分辨率**：PALM能够达到10-20纳米的分辨率，显著高于传统光学显微镜。

- **单分子灵敏度**：能够定位和检测单个荧光分子，适用于低丰度分子的研究。

- **活细胞成像**：PALM可以在活细胞中进行超分辨率成像，研究动态生物过程。

**缺点**：

- **复杂的样品制备**：需要特定的荧光蛋白和样品固定方法，制备过程较复杂。

- **长成像时间**：由于需要多帧成像，PALM的成像时间较长，可能影响活细胞动态过程的观察。

- **数据处理要求高**：单分子定位和图像重建需要复杂的计算和数据处理，需使用专门的软件和算法。

**PALM的改进和发展方向**：

1. **优化荧光蛋白**：开发更稳定、高效的光活化荧光蛋白，提高成像信噪比和分辨率。

2. **快速成像技术**：改进成像速度，减少活细胞成像时的光毒性和漂白效应。

3. **多色成像**：实现多种荧光分子的同时定位和成像，研究分子间的相互作用和共定位。

4. **自动化数据处理**：开发高效、自动化的数据处理软件，提高单分子定位和图像重建的效率。

**参考文献**：

1. Betzig E, Patterson GH, Sougrat R, et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 2006;313(5793):1642-1645.

2. Hess ST, Girirajan TP, Mason MD. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 2006;91(11):4258-4272.

3. Manley S, Gillette JM, Patterson GH, et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 2008;5(2):155-157.

4. Rust MJ, Bates M, Zhuang X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 2006;3(10):793-795.

5. Huang B, Babcock H, Zhuang X. Breaking the diffraction barrier: super-resolution imaging of cells. Cell. 2010;143(7):1047-1058.