细胞融合技术

细胞融合技术（以杂交瘤技术为例）

一、技术背景

细胞融合技术是制备单克隆抗体的核心步骤，通过将 免疫后的脾脏B淋巴细胞（具备抗体分泌能力但无法长期增殖）与 骨髓瘤细胞（具备无限增殖能力但不分泌抗体）融合，获得既能持续增殖又能分泌特异性抗体的 杂交瘤细胞。成功的关键在于 免疫方案设计、融合条件优化 及 高效筛选体系。

二、实验流程与关键步骤

1. 免疫处理

• 目的：激活小鼠脾脏中的抗原特异性B淋巴细胞，使其大量增殖并分化成浆细胞。

• 操作要点：

  • 抗原制备：纯化目标抗原（蛋白/多糖/细胞等），确保高免疫原性。

  • 免疫程序：

    • 初次免疫：抗原+弗氏完全佐剂（CFA）腹腔注射。

    • 加强免疫：间隔2-4周，抗原+弗氏不完全佐剂（IFA），共2-3次。

    • 终末免疫：融合前3天，直接静脉注射抗原（不加佐剂），最大化激活B细胞。

2. 细胞准备

• 脾脏细胞悬液：

  • 处死免疫小鼠，无菌取脾脏，研磨后过筛（70 μm细胞筛），获得单细胞悬液。

  • 去除红细胞（ACK裂解液处理），调整浓度至1×10⁷ cells/mL。

• 骨髓瘤细胞：

  • 选择缺乏HGPRT酶的骨髓瘤细胞系（如SP2/0或NS0），确保筛选可行性。

  • 使用对数生长期细胞（活力>95%），调整浓度至2×10⁶ cells/mL。

3. 细胞融合

• 融合剂：聚乙二醇（PEG 1500），浓度40-50%，作用时间1-2分钟。

• 操作步骤：

  1. 将脾脏细胞与骨髓瘤细胞按 10:1 比例混合（如10⁸脾脏细胞 + 10⁷骨髓瘤细胞）。

  2. 离心（1000 rpm，5分钟），弃上清。

  3. 逐滴加入预热的PEG，轻柔搅拌1分钟。

  4. 缓慢加入无血清培养基终止反应，离心后重悬于HAT培养基。

4. 筛选培养（HAT选择系统）

• HAT培养基成分：

  • 次黄嘌呤（H）、胸腺嘧啶核苷（T）：提供DNA合成旁路原料。

  • 氨基蝶呤（A）：阻断DNA主要合成途径（抑制二氢叶酸还原酶）。

• 筛选原理：

  • 脾脏细胞：无法长期增殖（自然凋亡）。

  • 骨髓瘤细胞：缺乏HGPRT酶，无法利用旁路途径合成DNA（死亡）。

  • 杂交瘤细胞：继承脾脏细胞的HGPRT酶和骨髓瘤的增殖能力（存活）。

5. 克隆化培养

• 有限稀释法：将初筛阳性孔细胞稀释至0.5-1 cell/孔，确保单克隆性。

• 抗体检测：ELISA/免疫荧光筛选高分泌孔，扩大培养并冻存。

三、关键影响因素与优化策略

四、应用与意义

• 单克隆抗体制备：用于疾病诊断（如ELISA试剂盒）、靶向治疗（如抗HER2曲妥珠单抗）。

• 细胞工程研究：构建分泌特定细胞因子的工程细胞。

• 药物筛选平台：表达膜受体的杂交瘤用于高通量药物筛选。

五、注意事项

• 无菌操作：全程超净台操作，避免支原体污染。

• 细胞活性监测：台盼蓝染色评估融合前细胞存活率（需>90%）。

• 筛选时间窗：融合后7-14天为重点观察期，及时标记阳性克隆。

总结：细胞融合技术的成功依赖于 精准的免疫方案、高效的融合条件 及 严格的筛选体系。通过优化各环节参数，可显著提高杂交瘤阳性率，为获得高特异性单克隆抗体奠定基础。