串联质谱标签
串联质谱标签（英文：Tandem Mass Tag， TMT）是一种用于高通量蛋白质组学（英文：Proteomics）的体外、多重化学标记定量技术。它通过特定的化学试剂对蛋白质酶解后产生的肽段进行标记，使得来自不同实验条件（最多可达18种）的样品可以在同一次质谱分析中被同时鉴定和定量，从而极大提高了定量精度、通量和实验效率。
核心原理
TMT试剂是一组具有相同化学结构但报告基团质量不同的等重异位标签。
结构：每个TMT分子包含三部分：
反应基团：与肽段N-末端氨基及赖氨酸侧链的ε-氨基发生共价反应，通常是胺反应性的琥珀酰亚胺酯。
质量平衡基团：确保来自不同标签的完整肽段离子（MS1水平）具有完全相同的质荷比（*m/z*）。
报告离子：一个在串联质谱（MS2或MS3）中可断裂产生的、具有独特低质量数（通常为126-131 Da）的离子。不同TMT试剂的报告离子质量不同，这是定量的关键。
工作流程：
样品制备与标记：将不同条件下的蛋白质样品分别提取、酶解成肽段。每个样品分别与一种特定通道的TMT试剂反应。
等量混合：将所有标记后的样品按等比例混合。
LC-MS/MS分析：混合样品经液相色谱分离后进行串联质谱分析。
MS1扫描：检测肽段母离子。由于质量平衡基团的存在，来自不同样品的同一肽段表现为一个单峰，避免了MS1谱图的复杂性。
MS2扫描：选择肽段母离子进行碰撞诱导解离。断裂主要发生在报告离子与肽段骨架的连接键上，产生两个关键信息：
a. 报告离子：产生一组低质量数的报告离子（每个通道一个），其强度比直接对应于原始样品中该肽段的相对丰度比。
b. 肽段碎片离子：用于肽段序列鉴定。
数据解析：通过专业软件（如Proteome Discoverer, MaxQuant）解析MS2谱图，一方面根据碎片离子鉴定蛋白质，另一方面根据各通道报告离子的强度进行肽段及蛋白质的定量。
技术优势
高通量多重定量：单次实验可同时比较多达16-18个样品（如不同时间点、药物浓度、患者样本），极大减少了仪器时间和批次效应。
高定量精度：由于所有样品在质谱分析前已混合，它们经历完全相同的色谱分离和离子化条件，定量比较的技术变异极低。
简化MS1谱图：等重设计避免了MS1层面的谱图重叠，提高母离子选择准确性和检测动态范围。
兼容性强：适用于多种样本类型，包括细胞、组织、体液（血浆、尿液）等。
表1：主流多重蛋白质组学定量标记技术比较
| 技术 | 标记原理 | 最大通量 | 标记阶段 | 主要优势 | 主要局限 |
|---|---|---|---|---|---|
| TMT | 体外化学标记（等重异位标签） | 16-18重 | 酶解后（肽段水平） | 通量高、精度高、减少批次效应 | 成本较高，可能存在“报告离子压缩” |
| iTRAQ | 体外化学标记（等重异位标签） | 4重或8重 | 酶解后（肽段水平） | 原理与TMT类似 | 通量较低，报告离子干扰更显著 |
| SILAC | 体内代谢标记 | 3重（常见） | 细胞培养期（蛋白质合成时） | 定量最精准，混合最早 | 仅限可培养细胞，通量低 |
| Label-Free | 非标记 | 理论上无限 | 无标记 | 成本低，样本处理简单 | 精度较低，批次效应需严格校正 |
挑战与解决方案
主要挑战：“报告离子压缩”
问题：在MS2碎裂中，来自同一母离子的共同碎裂的肽段（如共同洗脱的相似肽段）会产生干扰信号，导致报告离子强度比被压缩，使定量结果低估真实差异。
解决方案：
MS3定量：在线性离子阱-Orbitrap组合仪器上，对MS2产生的碎片离子再进行选择、碎裂（SPS-MS3）。MS3报告离子受干扰大大减少，定量准确性显著提高。
离子淌度分离：结合捕获离子淌度谱（英文：Trapped Ion Mobility Spectrometry， TIMS）在碎裂前增加一维分离（如timsTOF Pro上的PASEF技术），提高母离子选择特异性。
数据校正算法：开发算法（如“TMT校正因子”）对压缩效应进行软件校正。
数据分析流程
原始数据处理：使用Thermo Fisher的Proteome Discoverer（内置TMT定量模块）或其他软件（如MaxQuant， 最新版本支持TMT）进行数据库搜索和定量提取。
定量数据归一化：通常基于所有肽段的总信号强度或参考通道进行归一化，以校正混合时的误差。
统计学分析：使用
limma等统计模型进行差异蛋白质分析，并控制错误发现率。生物信息学解读：进行功能富集分析、通路分析等。
应用领域
系统生物学：研究细胞对药物、基因敲除/过表达、时间序列刺激的动态蛋白质组响应。
疾病生物标志物发现：比较健康与疾病组织（如肿瘤分型）的大量临床样本。
翻译后修饰分析：与磷酸化、乙酰化等修饰富集技术联用，进行修饰组学的多重定量。
蛋白质相互作用组学：对亲和纯化产物进行多重定量，区分特异性互作与非特异性背景。
参考文献
Thompson, A., et al. (2003). Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry, 75(8), 1895-1904. （首次报道TMT技术的论文）
McAlister, G. C., et al. (2014). MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes. Analytical Chemistry, 86(14), 7150-7158. （提出了解决报告离子压缩问题的SPS-MS3方法）
Meier, F., et al. (2018). Online Parallel Accumulation–Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics, 17(12), 2534-2545. （介绍了结合离子淌度分离以改善TMT定量等应用的新技术）
Pappireddi, N., Martin, L., & Wühr, M. (2019). A Review on Quantitative Multiplexed Proteomics. ChemBioChem, 20(10), 1210-1224. （全面综述了包括TMT在内的多重蛋白质组学定量技术）
Thermo Fisher Scientific. (2021). TMTpro 16/18plex: The next generation of isobaric labeling reagents for multiplexed proteomics. Application Note. （介绍了最新一代的TMTpro 16/18-plex试剂，代表了该技术的当前最高通量）
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