PCR

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外酶促合成特异DNA片段的方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几个反应步骤组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。PCR具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点，不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病诊断或任何有DNA、RNA的地方。该技术由美国PE公司遗传部的Kary Mullis发明，由于其在理论和应用上的跨时代意义，Mullis获得了1993年诺贝尔化学奖。

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP，就可以完成特定基因的体外复制。然而，早期DNA聚合酶在高温时会失活，因此每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作繁琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合酶——Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷，同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

标准的PCR反应体系如下：
10×扩增缓冲液10ul，4种dNTP混合物各200umol/L，引物各10～100pmol，模板DNA 0.1～2ug，Taq DNA聚合酶2.5u，Mg²⁺ 1.5mmol/L，加双或三蒸水至100ul。

PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种，即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg²⁺）。

标准的PCR过程分为三步：
1. DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。
2. 退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
3. 延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

特异性强：PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。
灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10⁻¹²）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=10⁻⁶）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速：PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。

1. 预变性：模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。
2. 引物退火：退火温度一般需要凭实验（经验）决定。退火温度对PCR的特异性有较大影响。
3. 引物延伸：引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。延伸时间随扩增片段长短而定。
4. 循环中的变性步骤：循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
5. 循环数：大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。
6. 最后延伸：在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟，使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

PCR产物的电泳检测时间：一般为48小时以内，有些最好于当日电泳检测，大于48小时后带型不规则甚至消失。

假阴性：不出现扩增条带。PCR反应的关键环节包括模板核酸的制备、引物的质量与特异性、酶的质量及PCR循环条件。寻找原因应针对上述环节进行分析：
- 模板：模板中含有杂蛋白质、Taq酶抑制剂、蛋白质没有消化除净（特别是染色体中的组蛋白）、提取制备模板时丢失过多或吸入酚、模板核酸变性不彻底等。
- 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用。需注意有时忘加Taq酶或溴乙锭。
- 引物：引物质量、浓度、两条引物的浓度是否对称是常见原因。对策：选定好的引物合成单位；引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳；引物应高浓度小量分装保存；引物设计不合理（如引物长度不够、形成二聚体等）。
- Mg²⁺浓度：浓度过高降低特异性，浓度过低影响产量甚至导致失败。
- 反应体积的改变：进行不同体积的PCR扩增时需摸索条件。
- 物理原因：变性温度低、时间短可致假阴性；退火温度过低致非特异性扩增，过高影响结合效率。
- 靶序列变异：如发生突变或缺失影响引物结合。

假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致。原因包括：引物设计不合适（扩增序列与非目的序列有同源性）、靶序列或扩增产物的交叉污染（整个基因组或大片段的交叉污染，或空气中的小片段核酸污染）。对策：操作小心轻柔，防止靶序列吸入加样枪或溅出；试剂及器材高压消毒，离心管及枪头一次性使用；必要时用紫外线照射；巢式PCR可减轻小片段污染。

非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致。原因：引物与靶序列不完全互补、引物聚合形成二聚体；Mg²⁺浓度过高、退火温度过低、PCR循环次数过多；酶的质量和用量。对策：重新设计引物；减低酶量或调换酶；降低引物量、适当增加模板量、减少循环次数；适当提高退火温度或采用二温度点法。

片状拖带或涂抹带：原因：酶量过多或酶质量差，dNTP浓度过高，Mg²⁺浓度过高，退火温度过低，循环次数过多。对策：减少酶量或调换酶；减少dNTP浓度；适当降低Mg²⁺浓度；增加模板量，减少循环次数。

聚合酶链式反应自1993年至今很快经历了四代产品：

第一代：手动/机械手式水浴。用三个恒温水浴箱分别恒定在高温变性温度（如94℃）、低温复性温度（如58℃）、适温延伸温度（如72℃），用手工或机械手移动标本试管。优点：设备简单，投资少，升降温过程直接，实验时间短。缺点：劳动强度大，易出差错，只能局限三个温阶，有液体污染，低气压地区水温难以达到94℃等。

第二代：自动化控制型定性基因扩增仪（干式基因扩增仪）。

第三代：终点定量/半定量。定性PCR只能判断阴性阳性，无法评价特定核酸的浓度及定量分析。定量PCR可实现潜伏期病毒浓度探测、感染程度评估、致病病原体数量变化测定、抗病毒药物疗效评估、恢复期病毒载量检测等。1996年美国ABI公司发明第一台荧光定量PCR仪。

第四代：实时定量PCR（real-time quantitative PCR）。实时定量QPCR仪+实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。

优势：实时荧光定量PCR系统由系统和计算机组成，监测循环过程中的荧光。数据通过实时分析软件以图表形式显示。样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值。通过标准曲线可以计算未知样品的浓度。

原理：在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程。早期Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现及标记探针的运用实现了在一密闭反应管中实时监测反应全过程。Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。

应用

临床检测：可对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。如结核菌基因诊断可区分TB与其他分枝杆菌、检测耐药基因、提高阳性检出率。

遗传病诊断：通过产前监测减少遗传病患儿出生。如检测SRY基因进行性别鉴定。

疗效考核：对乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）定量分析显示病毒量与药物疗效的关系。如HBV-DNA血清含量下降后再度上升提示病毒变异。

肿瘤研究：实时荧光定量PCR能有效检测基因突变和癌基因表达量。应用于端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因等多种基因的表达检测。

优生优育：在妊娠期对母亲及胎儿进行遗传学检查和病原体检测（如弓形体、风疹病毒、衣原体等）。PCR联合SSCP、RFLP、ASO或差异PCR可检出单个基因突变，准确性达95%以上。应用包括地中海贫血、苯丙酮尿症、血友病、性别发育异常、脆-X综合征等遗传病诊断，以及弓形体、风疹病毒、单纯疱疹病毒、沙眼衣原体、巨细胞病毒等病原体检测。

产品特点：
1. 一体机设计，PCR扩增反应和荧光激发检测一次完成，完成标准两步PCR扩增反应和定量荧光检测只需45～70分钟。
2. 应用专利技术实现快速高效均衡扩增检测，由光开关、自聚焦透镜和尾纤准直器及变增益O/E装置组成的MOMENS有机整体，能在毫秒级时间内完成对全部标本快速均衡扫描检测。
3. 采用先进膜加热及半导体热泵制冷技术，保证升降温的快速准确稳定。
4. 加有热盖设计，保证无矿物油操作。
5. 激发光源采用长寿命LED，终身免维护。
6. 采用日本原产光电倍增管和美国原产滤光片，保证检测的高灵敏度和高精确度。
7. 良好的线性范围达10～10000000000，灵敏度最小分辨率为1拷贝，重复性CV≤1%。
8. 样本载台参照0.2ml薄壁PCR离心管设计，通用性好。
9. 友好简体中文Windows操作界面。

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