RACE技术

RACE（rapid amplification of cDNA ends）是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，无需建立cDNA文库，可在短时间内获得有价值的信息。RACE基于PCR技术，由已知的一段cDNA片段，通过向两端延伸扩增，从而获得完整的3'端和5'端。

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一般分为5'-RACE和3'-RACE两种。

3'-RACE较简单，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，根据基因具有polyA尾巴的特点，选用特异引物（根据已知序列设计）和PolyT引物进行PCR。大多数实验者反映一次PCR可完成。 ADFASDFAF23RQ23R

5'-RACE相对较难，目前流行几种方法。其一为加接头法（传统），根据接头引物和特异引物进行PCR，可设计巢式PCR二次扩增。此外，还有利用反向PCR技术连接成环后进行PCR的方法。另外，GENE公司的SMART RACE PCR利用反转录酶末端加C的特性，直接加上多G接头转换模板，无需使用连接酶加接头。

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经典的RACE技术由Frohman等人（1988）发明，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列获得完整的cDNA 5'和3'端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术经不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点（Frohman等，1995；Schaefer，1995；Chen，1998；Bespalova等，1998；Matz等，1999）。对传统RACE技术的改进主要包括引物设计和RT-PCR技术的改进：改进之一是利用锁定引物（lock-docking primer）合成第一链cDNA，在oligo(dT)引物的3'端引入两个简并核苷酸【5'-Oligo(dT)16-30MN-3', M=A/G/C; N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始点，消除oligo(dT)与poly(A)尾任意部位结合的影响；改进之二是5'端加尾时采用poly(C)而非poly(A)；改进之三是采用RNaseH⁻莫洛尼氏鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶在高温（60-70℃）下有效逆转录mRNA，消除5'端高GC含量导致的mRNA二级结构对逆转录的影响；改进之四是采用热启动PCR和降落PCR提高PCR反应的特异性。

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随着RACE技术日益完善，目前已推出商业化产品，如Clontech的Marathon™技术和SMART™ RACE技术。邢桂春等（2001）先后使用上述两种试剂盒进行RACE反应，结果发现Marathon™所得片段总比SMART™ RACE试剂盒所得片段短，原因在于Marathon™技术的反转录反应往往不能真正到达mRNA的5'末端，因此认为进行RACE反应应优选SMART™ RACE试剂盒。 ADSFAEQWER353423413434

基因特异性引物（GSPs）应符合以下要求： ADFASDFAF23RQ23R

• 长度23-28 nt
• GC含量50-70%
• Tm值≥65℃，Tm值≥70℃可获得更好结果
• 根据已有基因序列设计5'和3' RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2）
• cDNA合成起始于polyA+ RNA，使用其他基因组DNA或总RNA会导致高背景
• RACE PCR效率取决于总mRNA中目的mRNA的量和不同引物的退火及延伸温度
• 进行5'和3' RACE PCR时应使用热启动
• 重叠引物的设计有助于全长产生，并为PCR反应提供对照
• 引物GSP的GC含量应在50-70%之间，以便使用降落PCR，避免使用自身互补的引物序列，避免产生回折和分子内氢键，避免使用与AP1互补的引物（尤其在3'末端）
• 若要用重叠片段检测引物，GSP1和GSP2之间至少相距100-200碱基
• 降落PCR可显著增加RACE PCR产物的特异性
• 验证基因特异性引物的对照：单个引物的阴性对照不应产生条带；利用两个GSP进行阳性对照（仅适用于可产生重叠时），以确定RNA样品中目的基因表达
• 制备和抽提polyA+ RNA时不要使用DEPC处理过的水，纯化mRNA后通过琼脂糖凝胶电泳检测mRNA质量

目的：研究环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法和SMART反转录酶法三种常用5' RACE技术的特点，并进行优化。 ADSFAEQWER353423413434

方法：以播娘蒿RNA为模板，先按文献标准方法进行5' RACE，通过增加反应时间、提高部分反应物浓度等方法进行优化。

结果：优化前环化法和TdT酶法条带几乎不可见，SMART反转录酶法隐约可见条带但不清晰。优化后，环化法出现弥散条带，TdT酶法略优但条带仍弥散，SMART反转录酶法最佳，获得清晰特异性条带。结论：SMART 5' RACE效果最好，其次为TdT酶法，环化法效果有待改进，通过优化条件可明显增加产物特异性。 ADSFAEQWER353423413434

cDNA第一条链的合成

建议进行cDNA合成的对照反应以鉴定样品cDNA的合成。加入各种试剂后，在气浴中42℃保温一小时。注意：水浴或酒精浴会减少反应体积，降低第一链合成效率。将管放于冰上终止反应，直接进行第二链合成。 ADFASDFAF23RQ23R

cDNA第二链的合成

第二链合成的酶混合物包含聚合酶、RNase H和连接酶。T4 DNA聚合酶用于补平dscDNA末端。建议进行阳性对照（试剂盒提供人类骨骼肌mRNA）。cDNA质量取决于polyA+ RNA的质量。非哺乳动物样品mRNA大小约0.5-3 kb。通过电泳检测cDNA产量并与对照对比，有利于后续对cDNA进行稀释。按照程序进行连接反应。若无可对比样品和对照产量，制备接头连接dscDNA的1/50和1/250稀释物进行RACE PCR，直至确定最佳稀释度。 ADSFAEQWER353423413434

进行5'和3'的RACE-PCR扩增

采用降落PCR程序：94℃ 30秒；5个循环：（1）94℃ 5秒，（2）72℃ 4分；5个循环：（1）94℃ 5秒，（2）70℃ 4分钟；20-25个循环：（1）94℃ 5秒，（2）68℃ 4分钟。注意：使用降落PCR要求GSP的Tm值≥70℃。循环结束后，取5μl产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，使用适当分子量marker。可根据基因特异性优化循环参数，若条带弱，可在68℃多加5个循环。最佳延伸时间取决于扩增片段长度：2-5 kb用4 min，0.2-2 kb用2-3 min，5-10 kb用10 min。 ADSFAEQWER353423413434

应对RACE片段进行验证以确认扩增了理想产物。有三种验证方法：

• 比较由GSP和NGSP获得的RACE产物
• Southern blot
• 克隆并测序

建议至少测定RACE产物的部分序列。对于5'末端产物，比较AP1/GSP1扩增产物与AP1/NGSP1扩增产物；对于3'末端产物，比较AP1/GSP2与AP1/NGSP2产物。若条带正确，嵌套PCR产物的条带应略微更小，迁移率差异取决于cDNA结构中GSP1与嵌套引物的位置。

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利用胶回收试剂盒回收RACE产物（适用于2.5 kb以下）；长片段可通过电洗脱获得。纯化后以30μl Tricine-EDTA buffer重悬DNA，电泳5μl鉴定回收质量。将回收产物直接克隆到T/A型PCR克隆载体中，或利用接头和cDNA合成引物中的Not I、Srf I、Xma I、EcoR I等酶切位点克隆到常规载体。对于5'端RACE产物，建议挑取至少8-10个不同克隆以获得最大可能的序列（反转录并非总能进行到mRNA模板5'端，尤其长模板；T4 DNA聚合酶会移除5'端0-20个碱基）。一旦鉴定含插入片段的克隆，应获取足够序列信息，理想情况下对整个开放读码框及5'和3'非翻译区进行测序。

通过部分或完全测序鉴定RACE产物后，可通过两种方法获得全长cDNA：PCR和克隆。 ADSFAEQWER353423413434

通过PCR获得全长cDNA

扩增长cDNA需较长延伸时间，但过长延伸会产生拖带，应慎重设计引物。根据5'和3' RACE产物序列信息设计5'和3' GSP引物（23-28 nt），不应在引物末端加限制性位点，以免高背景。可设计嵌套引物，但优先使用一对引物进行PCR。热循环：94℃ 30秒；25个循环：94℃ 5秒，72℃ 2-15分钟。延伸时间等于预期cDNA长度加2分钟。若条带弱，增加5个循环或优化PCR条件。在1.2%琼脂糖凝胶（TAE buffer）上分析5μl样品，若见单一条带，胶纯化全长cDNA。将剩余45μl反应物点样，使用长波紫外（≥300 nm）切下cDNA，尽量减少紫外照射。胶回收试剂盒适用于2.5 kb以下片段，长片段可用电洗脱。纯化后以30μl Tricine-EDTA buffer重悬，克隆到T/A型载体。

通过克隆产生全长cDNA

若已获得含重叠部分的5'和3' RACE产物，且重叠区含酶切位点，可通过克隆技术获得全长cDNA。利用内切酶切割3'和5'扩增产物，用T4 DNA连接酶连接，再利用接头和cDNA合成引物中的内切酶位点将全长cDNA克隆到载体。在哺乳动物基因组中，Not I和Srf I酶切位点非常稀少（约10⁶ bp出现一次），因此绝大多数cDNA中不出现。 ADFASDFAF23RQ23R

• Frohman, M. A., Dush, M. K., & Martin, G. R. (1988). Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer. Proceedings of the National Academy of Sciences, 85(23), 8998-9002.
• Schaefer, B. C. (1995). Revolutions in rapid amplification of cDNA ends: new strategies for polymerase chain reaction cloning of full-length cDNA ends. Analytical Biochemistry, 227(2), 255-273.
• Chen, Z. (1998). A simple and efficient method for 5′-RACE using high-quality RNA. Gene, 216(1), 147-153.
• Matz, M., Shagin, D., Bogdanova, E., et al. (1999). Amplification of cDNA ends based on template-switching effect: a promising approach to full-length cDNA library construction. Nucleic Acids Research, 27(6), 1558-1560.
• 邢桂春, 张维, 陈鹏, 等. (2001). 两种RACE试剂盒的比较及应用. 生物化学与生物物理进展, 28(4), 575-578.
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• Scotto-Lavino, E., Du, G., & Frohman, M. A. (2006). 5′ end cDNA amplification using classic RACE. Nature Protocols, 1(6), 2555-2562.
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