不对称PCR

1. 定义
   不对称聚合酶链式反应（Asymmetric Polymerase Chain Reaction，简称Asymmetric PCR）是一种改良型PCR技术，主要用于优先扩增某一条单链DNA。它通过使用非等量的引物，使某一链DNA在扩增中成为主要产物，广泛应用于寡核苷酸探针制备、单链模板构建、测序及杂交实验中。

2. 原理与方法
   传统PCR使用等量的正向和反向引物（forward primer 和 reverse primer）扩增目标区域，产物为双链DNA。而不对称PCR则在反应体系中加入正向与反向引物量不对称（一般为50:1至100:1），常见比例为：

• 正向引物（过量）：用于持续扩增；

• 反向引物（限制量）：扩增早期生成双链产物，一旦消耗殆尽，反应转向单链DNA扩增。

反应过程分两阶段：

• 初期若干个循环产生双链DNA；

• 限制性引物耗尽后，剩余引物继续复制某一链，生成大量单链DNA。

3. 技术参数

• 引物比例：50:1 或更高（如100:1）；

• 引物设计需具备高特异性，避免二聚体或自配对；

• 扩增周期通常较传统PCR长（可达40~50个循环）；

• DNA聚合酶需具备较强耐热性与过程性，如Taq或Pfu；

• 可配合凝胶电泳或实时荧光检测单链产物。

4. 应用
   （1）寡核苷酸探针合成：为分子杂交或microarray芯片制备提供单链模板；
   （2）单链DNA模板生成：用于测序、体外转录、突变分析、合成DNA纳米结构等；
   （3）SNaPshot 或 ARMS-PCR：用于单碱基突变检测或SNP分型分析。

5. 优缺点
   优点：

• 操作简便，仅需调节引物比例；

• 无需分离双链后再退火，可直接获得单链产物；

• 适用于多种DNA分子生物学分析。

缺点：

• 扩增效率较低，单链DNA产量有限；

• 对PCR条件与引物浓度依赖性强；

• 易产生非特异扩增，需优化退火温度与循环数。

参考文献：
(¹) Langer PR et al. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci USA. 1981.
(²) Gyllensten UB, Erlich HA. Generation of single-stranded DNA by the polymerase chain reaction and its application to direct sequencing of the HLA-DQA locus. Proc Natl Acad Sci USA. 1988.
(³) Innis MA, Gelfand DH. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press. 1990.