体外转录

1. 定义
   体外转录（In vitro transcription）是指在试管或反应管中，使用RNA聚合酶以模板DNA为蓝本合成RNA分子的过程，模拟细胞内的RNA合成，但在细胞外环境中进行。该方法广泛应用于RNA探针制备、mRNA疫苗、核糖体显示、RNA结构功能研究、体外翻译体系及CRISPR系统的gRNA合成等生物医学领域。

2. 原理与关键要素
   体外转录系统由下列基本组分构成：
   （1）DNA模板：通常为线性化的质粒或PCR产物，须包含启动子序列（如T7、T3或SP6）；
   （2）RNA聚合酶：来源于噬菌体，如T7 RNA polymerase，专一识别其启动子；
   （3）NTPs（ATP, CTP, GTP, UTP）：转录反应的基本原料；
   （4）缓冲液体系：包括Tris-HCl、Mg²⁺、DTT等，维持酶活性和离子环境；
   （5）酶抑制剂：如RNase inhibitor，防止RNA降解。

标准反应步骤包括：

• 模板DNA与反应组分混合；

• 恒温反应（一般为37°C，1–4小时）；

• 反应后可用DNase I消化模板DNA；

• 纯化RNA产物（如酚/氯仿抽提、柱纯化或LiCl沉淀）。

3. 常用启动子与聚合酶

• T7 RNA polymerase：识别5'-TAATACGACTCACTATA-3'序列；

• SP6 RNA polymerase：识别5'-ATTTAGGTGACACTATA-3'；

• T3 RNA polymerase：识别5'-AATTAACCCTCACTAAA-3'。
  这些聚合酶专一识别其启动子，不会在其他序列上启动转录。

4. 应用
   （1）RNA探针制备：用于Northern blot、in situ杂交、核酸芯片；
   （2）体外翻译模板：为无细胞翻译系统（如小鼠胚胎提取物）提供mRNA模板；
   （3）mRNA疫苗：如新冠疫苗BNT162b2和mRNA-1273均采用体外转录合成mRNA；
   （4）gRNA合成：CRISPR-Cas9系统中常以体外转录合成向导RNA；
   （5）RNA功能研究：结构分析、RNA剪接、核酶实验等。

5. 注意事项

• DNA模板必须无污染且完全线性化，否则易形成非特异产物；

• RNA极易被降解，实验器具需彻底去除RNase污染；

• 使用DEPC处理水和管材，并配合RNase抑制剂；

• 长片段RNA建议进行RNA电泳验证完整性。

参考文献：
(¹) Milligan JF, Groebe DR, Witherell GW, Uhlenbeck OC. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Res. 1987.
(²) Beckert B, Masquida B. Synthesis of RNA by in vitro transcription. Methods Mol Biol. 2011.
(³) Karikó K et al. In vitro-transcribed mRNA: past, present, and future. Mol Ther. 2011.