RAPD

RAPD（随机扩增多态性DNA技术）由美国科学家Williams和Welsh于1990年分别提出，又称任意引物PCR。其原理基于：对于同一模板DNA，用同一引物扩增可能得到相同或不同的带谱。仅在特定模板中出现的条带可作为分子标记。不同基因组DNA存在差异，因此RAPD可用于分子标记研究。理论上，扩增条带数取决于基因组复杂性：复杂性越高，扩增条带越多。90年代前期该技术广泛用于作物研究，但后续发现其存在缺陷并进行了改进。

• 无需预先设计引物或知道基因组序列，引物可随机合成（通常9-10个核苷酸）。
• 每个反应仅用单个引物，通过随机配对实现扩增，无特异性。
• 退火温度低（约36℃），允许适当错误配对，提高检出率。
• 简便易行，无需RFLP的克隆、同位素标记、Southern杂交等步骤，易于程序化。
• 所需DNA样品量极少（仅为RFLP的1/1000-1/200），利于早期取样或DNA受限情况。

1. 药品试剂

• 模板DNA（10～100 ng）
• 寡核苷酸引物（20 mmol/L贮存液）
• 0.2 mmol/L dNTPs（高质量，等量混合）
• Taq DNA聚合酶
• 10×PCR缓冲液（500 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2, 100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.3）
• 矿物油
• 电泳所需试剂

2. 仪器设备

• PCR扩增仪
• 电泳装置
• 微量离心机
• 微量移液器（1～20 μl和20～200 μl）
• 0.5 ml Eppendorf管
• 紫外线观察装置及照相设备

（1）在冰上向无菌Eppendorf管中加入以下反应物：

（2）93℃反应2 min后开始循环：93℃变性1 min，36℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共45个循环；最后一个循环72℃增加5 min，结束后4℃保存。

（3）取20 μl反应产物进行凝胶电泳，溴化乙锭染色检测扩增情况。

（1）扩增偏差或无扩增
——缺少组分：重复少量反应确认。
——PCR抑制物：改变DNA浓度或加纯化步骤（如苯酚抽提）。
——引物失效：重新配制或提高浓度。
——延长退火时间或降低升温速率。
——提高Taq聚合酶浓度。

（2）扩增结果差，条带模糊
——更换Taq缓冲液。
——检查引物（使用其他引物或末端标记检测）。
——检查Taq活性（与不同批次比较）。
——改变DNA浓度。

（3）高相对分子质量产物弥散分布（>4 kb）
——降低DNA或Taq浓度，减少上样量，减少循环数，确认缓冲液正确，降低电压。

（4）对照和样品均为一条很强单一带
——确认引物非回文结构，可能为引物二聚体，更换引物。

（5）带谱不可重复
——控制DNA浓度在10～100 ng，过多或过少均会导致假带；只考虑主要条带。

（6）染色后背景太强
——减少染色时间，延长脱色，降低DNA或Taq浓度。

（7）低相对分子质量产物分离不充分
——使用更高浓度琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶。

1. 温度
变性92-95℃（常用94℃）30-60s；延伸72℃ 60-120s；退火35-37℃ 30-60s。退火温度影响特异性：低温增加条带数，高温提高特异性。用于寻找基因差异时退火可采用33-34℃。温度梯度率（尤其退火至延伸）很重要，不同PCR仪存在差异，需注明仪器型号。

2. 反应物的影响
模板浓度是关键：过低则分子碰撞几率低，产物不稳定；过高则增加非特异性扩增，导致弥散。模板纯度影响不大。引物3'端重要性较高。Mg²⁺浓度一般在1.5-4 mmol/L范围内，需优化。

3. 污染问题
需设空白对照，排除引物、缓冲液、水及Taq酶污染。

4. 扩增条带的取舍
重复性问题：仅记录可重复的主要条带，带强弱不作为取舍指标。弱带可能由非特异性扩增或产物间退火造成。
异源双链问题：在F1代出现亲本没有的条带，可由等位基因形成异源双链，用单链核酸酶消除或将电泳温度升至60℃以上。
非孟德尔遗传的条带：约92.5%的清晰条带呈孟德尔显性遗传，其余可能由不同序列组成，通常只分析符合孟德尔遗传的条带。
同条带的同源性问题：种内同源性高，种间可能不同源（迁移率相同但序列不同），RAPD无法区分，需结合其他方法。

5. 电泳分辨率问题
不同分子量的扩增产物可能未分开，聚丙烯酰胺和银染的分辨率高于琼脂糖和溴化乙锭。长凝胶（20 cm）或高浓度（2%）琼脂糖可提高分辨率，但灵敏度提高可能增加实验误差。稳妥方法是用琼脂糖电泳并只关注重复性高的条带。

6. 显性标记问题
RAPD标记为显性，无法区分纯合和杂合。纯合位点和杂合位点的扩增产物量相差2倍但电泳无法检测。杂交中若亲本为纯合，F1全部显示该条带；若为杂合，F1呈1:1分离。

1. 遗传图谱构建的问题
RAPD为显性标记，不能区分杂合型和纯合型，在遗传分析中受限。解决方法：
①利用单倍体（如针叶树胚乳），可揭示减数分裂遗传事件，视为共显性标记。
②将RAPD条带作为单剂量标记（Single-dose markers），选择在一个亲本存在而另一个亲本不存在、且后代1:1分离的标记，采用双向假测交策略构建图谱，适用于多倍体植物和大基因组乔木。

2. 系统学研究中的问题
RAPD广泛用于亲缘关系分析，但存在局限：
①基因组RAPD位点可能未全部检出，造成假象；种间产物同源性难以判断，只能作表征分析。
②取样代表性：用个体代表种可能偏差，需找群体特异性条带。
③RAPD产物可能存在连锁关系，需注意性状加权。
④核基因组为有性二倍体，进化历史为网状分枝树，不便于二歧分枝树分析；叶绿体、线粒体等符合二歧分枝树假定，但基因组小，信息量低。
⑤RAPD与农艺性状的系统分析结果相似，但应结合其他方法提高可信度。

3. 标记、定位目的基因
RAPD探测全基因组变化，包括非编码区，与基因位点联系困难。策略：
①利用易位系、回复突变系、近等基因系（NILs）等特殊材料，回交6代以上即可。
②集团分离法（BSA）：基于F2分离群体，按表型分成两群，混合DNA构建池，寻找两池间唯一差异的条带作为连锁标记。
③利用缺体-四体或双端体系结合原位杂交进行染色体定位。找到标记后可通过YAC文库、染色体步移等方法克隆目的基因。

4. 纯度和外源基因检验问题
RAPD可用于品种纯度检验，已在大麦、玉米、大豆、棉花、小麦、水稻等作物中开展实验，有望在专利保护领域应用。

RAPD源于PCR，但差异主要体现在引物：RAPD使用单个随机引物（通常10 bp），而PCR使用一对特异性引物。RAPD退火温度较低（35-45℃）。由于使用随机引物，可检测多个位点，覆盖率大，PIC值在0.2-0.9之间。RAPD指纹呈孟德尔式显性遗传。

1. 植物药材相近种类的鉴定
邵鹏柱等（1994）用AP2-PCR鉴定人参和西洋参。1995年用RAPD区分人参、西洋参、三七及其伪品。曹晖等用RAPD鉴别蒲公英及土公英混淆品。Kohjyouma M等用RAPD区分苍术属五种植物。

2. 植物药材基原的鉴定
Yamazaki M等用RAPD鉴定甘草属植物及四种商品甘草的基原。曹晖等用AP2-PCR和RAPD鉴别地胆草及其混淆品，并证实商品苦地胆基原为地胆草。

3. 复方制剂、粉剂中药材品种的鉴定
Ozeki等用RAPD分析人参属植物及人参制剂，表明可从干燥药材和制剂中提取DNA进行鉴定。黄璐琦等用8个引物对26份天花粉样品进行聚类分析，有效区分不同来源。

4. 动物药材的鉴定
王义权等用RAPD检测六种蛇基因组DNA多态性，准确区分游蛇科5种和蝰蛇科1种，亲缘关系与染色体、颅骨研究一致。

5. 药材的野生类型与栽培品种的鉴定
马小军等用RAPD和AFLP标记区分人参、圆参与山参，长脖类型更接近野生人参。

6. 道地药材鉴定
胡珊梅等用RAPD研究泽泻道地药材与非道地药材的遗传变异，建立品质鉴定方法。分子标记为道地药材快速鉴定提供新途径。

RAPD标记广泛应用于分子生药学：
①生物多样性：研究药用植物遗传多样性，指导资源保护和开发。
②生药分类：在DNA水平鉴别不同种、亚种、变种或株系。
③系统发育分析：构建树状图，尤其适用于种内水平。
④基因图谱构建和基因定位。
⑤遗传连锁图谱构建，辅助药用植物育种。