嘌呤霉素

1. 基本信息

• 化学名称：嘌呤霉素（Puromycin）

• 来源：由 Streptomyces alboniger 放线菌产生的氨基核苷类抗生素。

• 分子式：C₂₂H₂₉N₇O₅

• 分子量：471.51 g/mol

• 结构特征：结构与氨酰-tRNA的3'端相似，可模拟tRNA进入核糖体A位，终止肽链合成。

2. 作用机制

（1）抑制蛋白质合成

• 靶点：作用于原核与真核生物核糖体，干扰翻译过程。

• 机制：

  1. 模拟氨酰-tRNA：嘌呤霉素的3'端与氨酰-tRNA类似，与核糖体A位结合。

  2. 肽链转移：核糖体误将其作为底物，将新生肽链转移至嘌呤霉素分子上。

  3. 提前释放：肽酰-嘌呤霉素复合体从核糖体脱落，导致翻译提前终止。

（2）选择性毒性

• 广谱抑制：对细菌、真核生物（包括哺乳动物细胞）均有效，但主要用于实验室研究。

• 不可逆效应：一旦结合核糖体，无法通过移除药物逆转作用。

3. 主要应用

（1）细胞筛选（如稳定转染株筛选）

• 原理：将嘌呤霉素抗性基因（如 pac 基因）与目标基因共转染至细胞。

  • 成功转染的细胞：表达嘌呤霉素N-乙酰转移酶（PAC），使药物失活。

  • 未转染的细胞：无法代谢嘌呤霉素，蛋白质合成被抑制而死亡。

• 操作步骤：

  1. 转染后48小时，加入嘌呤霉素（浓度通常为1-10 μg/mL）。

  2. 持续筛选5-7天，仅保留抗性细胞克隆。

（2）蛋白质合成研究

• 标记新生蛋白：短时间处理（如10-30分钟）后，通过Western blot检测被嘌呤霉素终止的肽链（利用抗嘌呤霉素抗体）。

• 核糖体图谱分析：结合高通量测序，解析翻译中的mRNA位置。

（3）诱导细胞凋亡

• 长期处理：持续抑制蛋白质合成导致细胞应激（如未折叠蛋白反应），激活caspase通路。

4. 实验操作指南

（1）浓度优化

• 哺乳动物细胞：常用浓度 1-10 μg/mL（需预实验确定，如HeLa细胞常用2 μg/mL）。

• 细菌/原核生物：较少使用，因多数实验选用其他抗生素（如卡那霉素）。

（2）处理时间

• 筛选应用：持续处理5-7天，每日观察细胞状态。

• 蛋白质标记：短暂处理（10分钟至2小时）后立即裂解细胞。

（3）注意事项

• 溶剂：通常溶于无菌水或缓冲液（如PBS），避光保存（-20℃）。

• 细胞状态：处理前确保细胞处于活跃增殖期（对数生长期）。

• 毒性控制：避免高浓度长时间暴露，以防非特异性细胞死亡。

5. 与其他抗生素的对比

6. 毒性及安全须知

• 细胞毒性：快速抑制蛋白质合成，导致细胞死亡（EC₅₀通常为1-5 μg/mL）。

• 动物实验：

  • 小鼠腹腔注射LD₅₀约为300 mg/kg，高剂量引发肝肾损伤。

  • 不适用于体内治疗（因全身毒性）。

• 操作防护：

  • 穿戴手套、护目镜，避免吸入或接触皮肤。

  • 废弃液按生物有害废物处理。

7. 研究进展

• 新型衍生物开发：

  • 光激活嘌呤霉素：通过光照控制活性，实现时空特异性蛋白质合成抑制。

  • 荧光标记嘌呤霉素（如TAMRA-puromycin）：实时追踪新生蛋白质。

• 癌症研究：

  • 联合自噬抑制剂（如氯喹），增强肿瘤细胞对嘌呤霉素的敏感性。

• 神经科学：

  • 研究突触局部蛋白质合成（如树突翻译）的动态调控。

8. 实验案例

（1）稳定细胞系构建

1. 将含有 pac 基因的质粒转染至HEK293细胞。

2. 转染48小时后，加入嘌呤霉素（2 μg/mL）。

3. 每2-3天更换含药培养基，持续1周。

4. 剩余细胞即为稳定转染株，扩增后用于后续实验。

（2）新生蛋白质标记

1. 细胞培养至80%密度，加入嘌呤霉素（10 μg/mL）处理30分钟。

2. 裂解细胞，使用抗嘌呤霉素抗体通过Western blot检测新生蛋白。

9. 局限性与挑战

• 非特异性杀伤：无法区分目标蛋白与背景蛋白的合成。

• 抗性基因依赖：仅适用于已导入 pac 基因的细胞。

• 代谢干扰：可能影响细胞能量状态（如ATP水平）。

总结

嘌呤霉素通过模拟tRNA终止肽链合成，成为实验室中筛选稳定细胞系和研究蛋白质合成的关键工具。其快速作用与广谱毒性要求精确控制浓度与处理时间。未来研究或通过工程化改造提升其选择性，并结合新技术（如单细胞分析）深化动态机制解析。在应用中需平衡效率与毒性，确保实验结果的可靠性。