异质体

探讨甲胎蛋白（AFP）异质体的检测在儿科肿瘤诊断中的临床应用价值。方法根据刀豆素A对AFP亲和力的不同，采用亲和交叉免疫电泳自显影术检测AFP异质体。结果恶性胚芽细胞肿瘤出现双波图像，且非结合型波（NR波）＞30%；恶性肝脏疾病也出现双波图像, 但NR波＜15%；良性胚芽细胞肿瘤可呈单波或双波图像, 但NR波极小；良性肝脏疾病仅出现单波图像。结论AFP异质体的检测能为儿童良、恶性肝脏疾病及良、恶性胚芽细胞肿瘤的术前鉴别提供有效的实验室依据。

甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein, AFP)是一种含有2条复合糖链的胚源性糖蛋白，60年代起，就将其作为肝脏恶性肿瘤的标志物。许多儿科疾病能引起AFP升高，但不同疾病导致的AFP升高，由于来源不同，其分子在糖链结构的亚结构上表现不同。这种结构上的差异，常称AFP异质体(Alpha-fetoproteine heterogeneity)。可利用具有结合糖专一性的植物凝集素与AFP不同的亲和力将其来源予以判别。我们对一组年龄＜12岁，患有不同疾病，且伴有AFP值升高的病儿应用亲和交叉免疫电泳自显影术检测AFP异质体，以探讨其对儿科鉴别恶性肿瘤等疾病的应用价值。

材料

一、标本来源

收集本院20例AFP阳性(＞20 μg/L)患儿血清标本，年龄均＜12岁（中位年龄3个月）。其中胚芽细胞肿瘤8例、肝母细胞瘤2例、肝细胞癌1例、先天性胆道闭锁4例、患有其他疾病的血清标本5例，肿瘤病例均经病理确诊。

二、试剂和仪器

1.试剂：(1)刀豆素A(Con A，美国Sigma公司），(2) 巴比妥-巴比妥钠缓冲液(0.02 mol/L，pH 8.6)，(3) 1%琼脂糖溶液，(4)125I同位素干粉和AFP抗血清干粉（上海生物制品研究所）。

2.仪器：(1)IMx(美国Abbott)，(2)电泳仪SCR-300型。

方法

AFP定量：按Abbott的IMX仪操作说明书进行测定。

AFP异质体测定：

1. 称取5mg ConA加入0.2 ml缓冲液溶解，置56℃预温，再加入已预温至56℃的1%琼脂糖溶液5 ml，混匀，在6 cm×10cm玻璃板一侧浇注2cm×10cm的凝胶条。距阴极端1.5cm处加入50μl待检血清及3μl溴酚兰，纱布搭桥，平衡后作第一向亲和电泳(140 v, 1.5～2 h)。

2. 吸取1%琼脂糖溶液10 ml，加0.12 ml AFP抗血清，混匀，浇注入玻板的剩余部分。再在第一向亲和电泳凝胶条上，血清电泳行径的阴极侧，切割0.3 cm×7 cm的狭槽，以含5～10 μl 125　I琼脂糖溶液充填，与第一向免疫电泳垂直做第二向免疫电泳(50 v, 16～18 h)。

3. 电泳结束后，将凝胶板置于80～90℃的水浴锅上烘干约1 h。在暗房中覆盖X胶片自行曝光48 h，冲洗成像。

4. 计算：在亲和交叉免疫电泳自显影图中通常可出现2个峰，靠近加样端峰为结合型AFP(R波)，远离加样端峰为非结合型AFP(NR波)。干燥后将底片置于小方格纸上(每格1 mm2)，计数两峰各自所占的小格数，按下式计算NR波的百分比［2］：NR(%)=(NR波所占小格数)/(R波所占小格数+NR波所占小格数)×100%

结果

1. AFP异质体电泳图像呈3种典型类型：良性肝脏疾病型(BLD)，卵黄囊瘤型(YST)，原发性肝细胞癌型(PHC。

(1)良性肝脏疾病型，(2)卵黄囊瘤型(NR波＞30%)，(3)原发性肝细胞癌型(NR波＜15%)AFP异质体电泳图像的3种类型

2. 20例患儿血清标本AFP值和NR%及与电泳图像的关系：表1中，前8例为胚芽细胞肿瘤，其中2例卵黄囊瘤、2例恶性畸胎瘤、2例胚胎癌呈明显的双波图像，其NR波与R波都接近或超过R波；而在2例新生儿良性畸胎瘤的电泳图像中，1例呈单一高大的R波，另1例仅有微小的NR波。表1中9～20例为其他疾病患儿：2例肝母细胞瘤及1例肝细胞癌的电泳图像中均呈高大的R波，而NR波较小。4例先天性胆道闭锁患儿的电泳图像中，仅有一高大的R波，无NR波出现。另5例其他病例标本均表现为单一的R波。

表1　胚芽细胞肿瘤及其他疾病的电泳波型与患儿AFP值和NR(%)的关系

病例号   疾病     年龄   部位   AFP值(ng/ml)   电泳像    NR%

1      恶性畸胎瘤  4月   骶尾部    980          双波    69.8

2 胚胎瘤 10月 右睾丸 998 双波 54.9

3 卵黄囊瘤复发 　9岁 骶尾部 40 双波 46.4

4 恶性畸胎瘤 17月 骶尾部 305 双波 39.3

5 胚胎瘤 18月 左睾丸 85 双波 31.6

6 卵黄囊瘤 11岁 左卵巢 1 147 双波 49.2

7 良性畸胎瘤 ＜0.5月 骶尾部 1 881 双波 7.6

8 良性畸胎瘤 ＜0.5月 骶尾部 718 单波

9 肝母细胞瘤 　5月 　 174 双波 5.4

10 肝母细胞瘤 ＜1月 　 1 333 双波 9.7

11 肝细胞癌 　5岁 　 670 双波 12.5

12 胆道闭锁 　3月 　 313 单波

13 胆道闭锁 　4月 　 224 单波

14 胆道闭锁 　2月 　 1 488 单波

15 胆道闭锁 1.5月 　 2 278 单波

16 幽门肥厚 　3月 　 292 单波

17 巨结肠 1.5月 　 329 单波

18 新生儿黄疸 0.5月 　 776 单波

19 肠闭锁术后 1月 　 991 单波

20 新生儿肺炎 0.5月 　 1 593 单波

恶性胚芽细胞肿瘤(1～6例)NR的百分面积值大于儿童肝脏恶性肿瘤(9～11例)，2组资料差异有非常显著意义。

3. 相关分析说明：不论AFP异质体图像出现双波还是单波，其NR(%)与AFP含量之间无相关关系(出现双波r=0.59，出现单波r=0)。

甲胎蛋白(AFP)是一种含有N－连接的双糖链分子结构的糖蛋白，可来源于胎儿肝脏和卵黄囊。不同来源的AFP在糖链结构上存在一定的区别，这种分子结构上的差别可通过植物凝集素与其不同的亲和力将其检出，通常将这种不同构型的AFP称为AFP异质体或亚型［3-6］。在某些儿童疾病中能发现血清AFP异常升高，如：性腺或性腺外卵黄囊瘤、恶性畸胎瘤、胚胎瘤、肝母细胞瘤、原发性肝细胞癌、肝硬化、胆道闭锁、肝炎等。由于新生儿或小婴儿正常血清中AFP也可高于正常值，且AFP含量难以提示AFP阳性疾病之间的区别，因此利用不同来源的AFP与植物凝集素亲和力不同，通过亲和交叉免疫电泳将其检出，为临床提供有效的辅助诊断依据。我们应用Con A检测AFP异质体，不同的AFP电泳图像可以对不同原因导致AFP升高的现象进行解释。从本组8例胚芽细胞肿瘤患儿血清AFP异质体图像分析，6例恶性胚芽细胞肿瘤中(1例为小于6个月的小婴儿）均出现双波图像，其中NR波接近或明显大于R波，NR波所占面积为31.6%～69.8%；而2例新生儿良性畸胎瘤中1例仅有高大的R波，另1例在高大的R波后有一微小的NR波，NR波仅占7.1%。据文献报道，在成人不同疾病类型AFP图像中，卵黄囊瘤型(包括恶性畸胎瘤、胚胎癌)患者应用Con A检测 AFP异质体，R波和＞25%的NR波为其特点之一。本组儿童病例与之比较，结果相似，但NR波均＞30%。为此，我们认为，应用Con A检测AFP异质体对于新生儿、小婴儿恶性胚芽细胞瘤的术前诊断和术后监测有无肿瘤残存和复发是一种有效的手段。对中国儿童的具体适用标准，仍有待资料的进一步积累和完善。但一个双波图像，且NR波接近或大于R波为其基本特征。

除正常新生儿血清中AFP可升高外，在儿童可导致AFP异常升高的疾病较多。但主要有下列3类：

(1)良性肝脏疾病：如肝炎、胆道闭锁肝脏损伤、肝硬化；

(2)肝脏恶性肿瘤：如肝母细胞瘤、原发性肝细胞癌；

(3)恶性胚芽细胞肿瘤：卵黄囊瘤、胚胎癌、恶性畸胎瘤；

其他如胃肠道病变也有引起AFP升高的报告，但在儿童中较为少见。不同疾病导致AFP升高，由于来源不同，其分子在糖链结构的亚结构上表现不同，利用Con A检测的电泳图像上亦表现有明显的区别。Ishiguro等报告小儿AFP异质体的电泳图像也和成人一样可被分为良性肝脏疾病型、原发性肝细胞癌型和卵黄囊瘤型。我们的研究资料表明，各类AFP异质体的电泳图像也有类似的规律。其中，NR波的有无及大小是其主要特征。良性肝脏疾病无NR波出现。而有双波变化的恶性肝脏肿瘤和恶性胚芽细胞瘤之间NR波亦有明显的区别，本组恶性肝脏肿瘤的NR波所占面积均＜15异质体
，而恶性胚芽细胞肿瘤的NR波均＞30%，与国外文献报道的前者NR波所占面积的参考值为＜25%，而后者NR的参考值为＞25%基本一致。

以Con A通过亲和交叉免疫电泳自显影术，鉴别不同疾病导致的AFP异常升高，通过NR波的有无及大小为儿童良、恶性肝脏疾病及良、恶性胚芽细胞肿瘤的术前鉴别诊断提供了有效的实验室依据。