聚合酶链反应

聚合酶链式反应，其英文PolymeaseChainReaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。

 

聚合酶链式反应（PCR）是20世纪80年代后期由K.Mullis等建立的一种体外酶促扩增特异DNA片段的技术。PCR是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行的DNA体外合成反应。由于反应循环可进行一定次数，所以在短时间内即可扩增获得大量目的基因。 PCR技术具有灵敏度高、特异性性强、操作简便等特点。虽然PCR技术也存在出错倾向高、产物大小受到限制和必须预先有目标DNA序列等缺点，但仍被誉为20世纪分子生物学研究领域最重大的发明之一。Mullis也因贡献卓著而获得1993年度诺贝尔奖。目前，PCR技术已广泛应用于分子生物学的各个领域，在分子克隆、法医学鉴定、DNA序列分析、致病基因的检测及考古学等方面都发挥着重要作用。

1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构及半保留复制模型。
1958年，Meselson和Stahl用实验证实DNA半保留复制模型。
70年代以来，人们采用两种思路去尝试建立基因的无性繁殖体系，一是基因克隆技术，二是体外扩增技术。1971年，Khorana（美国MIT教授，1968年诺贝尔医学奖得主）：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。”但由于很难进行测序和合成寡核苷酸引物，同时1970年Smith等发现了II型限制性内切酶，体外克隆基因已成为可能，核酸体外扩增最早设想被人们遗忘。 1976年，台籍科学家钱嘉韵（Alice Chien）从黄石国家公园的嗜热菌Thermus aquaticus中分离出热稳定的Taq DNA聚合酶。
1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的Mullis发明聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），Saiki等首次应用PCR法成功地扩增了人β-珠蛋白的DNA，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。
1988年Saiki开始将耐热性Taq DNA聚合酶应用于PCR，整个反应只加一次酶即可，扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。
1989年被誉为“分子年”，列PCR为十余项发明之首。
1993年，Mullis荣获诺贝尔化学奖。

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。在生物体内，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，在生物体外，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以实现特定基因的体外复制。
PCR通过变性、退火、延伸三个基本步骤完成一个循环。多次循环后，目的DNA可得以迅速扩增。理论扩增率为2n递增（n为循环次数），25～30循环，目标DNA可增加109倍。由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以并不是循环次数越多越好。实际进行30个循环后，扩增倍数一般可达106～107。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。　

标准的PCR过程分为三步，每一步的转换通过温度的改变控制。
1.DNA模板解链（变性）（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA
2.引物与模板结合（退火）（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
3.DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）（70℃-75℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。
此循环反复进行，可使目的DNA得以迅速扩增。

标准的PCR反应体系

10×扩增缓冲液10ul
4种dNTP混合物各200umol/L
引物各10～100pmol
模板DNA0.1～2ug
TaqDNA聚合酶2.5u
Mg2+1.5mmol/L
加双或三蒸水至100ul
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)

引物

PCR 产物的特异性取决于寡核苷酸引物与模板DNA互补的程度。引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。反应中的引物至少应含有18个与模板序列完全互补的核苷酸（常用软件通常默认为20个），最大不能多于38个，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性这样才能保证扩增反应的特异性。引物扩增跨度以500核苷酸为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。引物碱基的G+C含量以40-60%为宜，太少扩增效果不佳，过多易出现非特异条带。同时ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3′端不应超过3 个连续的G或C，因为这样会使引物在G+C富集区引发错误延伸。控制引物的浓度，避免引物内部出现二级结构和引物间互补。引物 3’端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰），引物5′端可修饰，加上限制内切酶位点、启动子序列或其它序列等，以便于PCR产物的分析克隆。

DNA聚合酶

最常用的是耐热Taq DNA聚合酶。目前有两种市面上有两种Taq DNA 聚合酶供应，一种是从水生嗜热杆菌中提纯的天然酶；另一种是由大肠菌合/成的基因工程酶。一个典型的 PCR反应约需酶量1- 2.5U/100 ul体系，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。Taq 酶在95℃持续温育仍能保持活性，因此引物的退火和延伸可以在更高的温度下进行，使引物与模板的误配大大减少。然而TaqDNA酶5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，无3’→5’外切活性，在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能的。保真性不如Pfu DNA聚合酶等。
此外还有Vent DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶。

四种dNTP

在PCR反应中，dNTP应为50～200μM，浓度过低会降低PCR产物的产量。配制过程注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ）,如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。而高浓度的dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。

模板DNA
模板DNA的来源有三种，可从微生物中或血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞等细胞中提取DNA，也可将固定和包埋的组织标本脱蜡、蛋白酶K消化后提取DNA。模板DNA的浓度常为0.1～2ug/100ul体系。PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高。

Mg2+
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。在一般的 PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜，Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

温度与时间
标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃退火，然后快速升温至70～75℃延伸，对于较短靶基因（长度100～300bp）可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸。变性温度与时间一般93℃～94℃，1min足以使模板变性。若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。退火温度是影响PCR特异性的重要因素。退火(复性)温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作为选择最适退火温度的起点较为理想。一般试验中退火温度比扩增引物的融解温度TTm低5℃，可按公式进行计算：
Ta = Tm -5℃= 4(G+C) 2(A+T)-5℃
其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。例如，20个碱基的引物，如果（G C）%含量为50%时，则Ta的起点可设在55℃。在典型的引物浓度时（如0.2μmol/L）,退火反应数秒即可完成，长时间退火没有必要，一般为30～60s，足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度一般选择在70～75℃之间，延伸温度高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间根据待扩增片段长度而定，1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够），3～4kb的靶序列需3～4min，扩增10kb需延伸至15min。延伸时间过长会导致非特异性扩增。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

循环次数
PCR反应的循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般为25~35次，此时PCR产物的积累即可达到最大值。

增强剂
PCR反应中加入一定浓度的增强剂如DMSO（1%~10%）、甘油（5%~20%）、非离子去污剂、甲酰胺（1.25%~10%）和牛血清白蛋白（10~100μg/ml）等可提高反应特异性和产量，有些反应只能在这些辅助剂存在时才能进行。但需要注意的是，这些增强剂浓度过高时不仅不能提高PCR反应的特异性和产量，还会对PCR反应产生抑制作用。

热启动PCR
即首先将模板变性，然后在较高温度时加入Taq DNA聚合酶、引物及MgCl2等一些重要成分，这样使得引物在较高温度下与模板退火，提高了反应的严谨性，使扩增更特异。

PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴乙锭）染色凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。

兼并引物PCR（DegeneratePrimer PCR）

密码子具有兼并性，单以氨基酸顺序推测编码的DNA序列是不精确的，但可以设计成对兼并引物，扩增所有编码已知顺序的核酸序列。用兼并引物时寡核苷酸中核苷酸序列可以改变，但核苷酸的数量应相同。兼并度越低，产物特异性越强，设计引物时应尽量选择兼并性小的氨基酸，并避免引物3’末端兼并，针对兼并的混合引物已成功地用于未知靶DNA的扩增、克隆和序列分析。现已成功地克隆了猪尿酸氧化酶基因、糖尿病相关肽基因和哺乳动物与禽类的嗜肝病毒基因。用脱氧肌苷（deoxyinosine；DI）引物进行PCR，可以代替编码蛋白的多种兼并密码子中的兼并碱基，DI的特异性主要受cDNA浓度影响。 

套式引物（NestedPrimer）PCR
用第一套引物扩增15～30个循环，再用扩增DNA片段内设定的第二套引物扩增15～30个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增，而次级结构却很少扩增。用起始引物限量方法或Centricon30(Amicon)分子滤过器离心，在第二套引物加入前去除第一引物。此方法已成功地用来分析中国仓鼠卵巢细胞AS52的分子突变。AS52细胞含有单拷贝的细胞gpt（guanine phos－phribosytransferase）基因，与哺乳动物具有同源性。套式引物PCR减少了引物非特异性退火，从而增加了特异性扩增，提高了扩增效率。对环境样品中微生物检测和单拷贝的基因靶DNA的扩增是非常有效的。
若将套式PCR的内外引物稍加改变，延长外引物长度（至25～30bp），同进缩短内引物长度（15～17bp），使外引物先在高温退火温度下做双温循环扩增，然后改换至三温循环，使内引物在外引物扩增的基础上作低温火温度的三温循环直到扩增完成，这样就可以使两套引物一次同时加入，两种循环一气呵成，等于只做一次PCR，而灵敏度与套式二次PCR无异，在我们最近推出的PTc 51气流式DNA热循环仪上就可以完成全部程序。套式一次PCR的成功，使PCR检测的全过程可以在5h内完成，使当天出检验报告成为现实，也使PCR检测走入临床有了现实的基础。

复合PCR（Multiplex PCR）
用多对引物同时扩增几条DNA片段的方法称为复合PCR。这一方法最初是由Chanberlain 等检测人的基因发展而来。Bej等随之发展了对环境样品中不同属细菌相关基因序列同时PCR扩增的检测方法。两种不同的军团菌（legionella）基因，一为特异嗜肺L基因（mip），另一种为L-5SrRNA基因，通过引物摇摆（staggered）添加进行复合PCR。首先mip引物PCR扩增7个循环，然后加入5SrRNA引物PCR扩增38个循环。加入不同量的LacZ和LacB基因引物进行PCR扩增可以检测大肠杆菌和与人类粪便污染有关的细菌包括E.coli大肠菌、肠源致病沙门氏菌和志贺氏菌。
在复合PCR中，所有引物Ta值应相近。如果两对引物Tq值差异超过±℃10%，会使扩增产物的量明显不同，其中一种扩增产物或目的DNA很难观察到。另外，靶DNA的长度也应相近，差别大时短片的靶DNA会优先扩增，因此，会产生不同产量的扩增产物，为此，须采用DNA摇摆扩增或加入不等量的引物方法进行解决。

反向PCR（Inverse PCR或Reverse PCR）

反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段；现已制备了酵母人工染色体（YAC）大的线状DNA片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。
该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。
利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知DNA片段的序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆，建立全长的DNA探针。适用于基因游走、转位因子和已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。

不对称PCR（Asymmetric PCR）
不对称PCR的基本原理是采用不等量的一对引物产生大量的单链DNA（ss-DNA）。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物；其最佳比例一般为1：50～1：100，关键是限制引物的绝对量。限制性引物太多太少，均不利于制备ss-DNA。也可用普通PCR制备靶DNA双链DNA（ds-DNA），再以ds-DNA为模板，只用其中一种过量引物进行单引物PCR制备ss-DNA。产生的ds-DNA与ss-DNA由于分子量不同可以在电泳中分开，而得到纯ss-DNA。不对称PCR主要为测序制备ss-DNA，尤为用cD－NA经不对称PCR进行DNA序列分析是研究真核DNA外显子的好方法。

标记PCR（LP-PCR）和彩色PCR
LP-PCR（Labelled Primers PCR）是利用同位素、荧光素等对PCR引物5’端进行标记，据此检测目的基因的存在与否，与常规PCR相比更为直观，省去了限制性内切酶酶切及分子杂交等繁琐步骤，而且一次可以同时分析多种基因成分，因而特别适合于大量临床标本的基因诊断。该方法只对PCR产物进行定性鉴定。
彩色PCR（Colorcomplement assay）直译为“着色互补性检测”，是LP-PCR的一种，彩色PCR意译更为明确：它用荧光染料标记引物的5’端。 荧光染料JOE和FAM呈绿色荧光；TAMRA呈红色荧光；COUM呈蓝色荧光。不同荧光标记的引物同时参加反应，扩增后的目的基因会分别带有引物5’端的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可以根据不同荧光的色泽判断目标基因是否存在及扩增基因的类型。通常仅需2种不同颜色的引物，一种作为基因检测引物；另一种作为控制条件的内对照，即可诊断基因缺失、染色体易位或感染某种病毒。检测多种点突变时，可用更多的色彩，如多点突变的遗传病、几种可疑病毒感染、HLA位点分析都可以用彩色PCR同时检测多个位点。

加端PCR
加端PCR（add-PCR）是使扩增产物的5’-末端加一段DNA顺序的PCR。设计加端PCR的引物时，除与模板配对的那一部分外再加上若干碱基，这样使扩增产物的末端加上额外一段DNA，如加上一个限制酶的识别顺序或特定功能的DNA片段。Stoflet等报道在结构基因前加上噬菌体T7的启动子，当然也可用于DNA片段的末端标记或引入特定的点突变。末端可加碱基的数量与引物的长短有关，当引物足够长时扩增产物或末端甚至可以加上十几个到几十个碱基。

锚定PCR或固定PCR
锚定PCR（AnchoredPCR，A-PCR）主要用于分析具有可变末端的DNA序列，Loh等用A-PCR对人外周血淋巴细胞T细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA，并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个PolyG尾巴。Loh等恒定区与可变区连接部位设一个引物，另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明A-PCR不对任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位抗体基因的研究。

玻片PCR
在聚丙烯管中可以对多种含膜板材料进行PCR，而在显微玻片上用组织细胞涂片或切片直接进行DNA扩增的方法就称为玻片PCR（Slide-PCR）。先将细胞涂片或呈单层细胞，然后用甲醇/醋酸（3：1，V/V）、Carnoy溶液、无水乙醇或4%多聚甲醛溶液固定5～15min。用蒸馏水冲洗，干燥，直接使用或保存于-20℃备用。在玻片上划20mm×28mm为免疫组化反应区。加入30μl PCR反应混合液，其中含10mmol/L TrispH8，3,50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/l dNTPs，100nmol/L引物，0.01%（V/V）明胶，0.2%BSA，2.5u/100μl Taq酶。然后盖上22mm×40mm的盖玻片，边缘用石蜡油封好。把玻片放入PCR热循环仪金属块上，使金属块与样品呈最大程度接触，同在聚丙烯管中一样，进行30～40个循环。对于较短的扩增片段在后期循环中变性温度可降低。反应后，将致冷玻片放在氯仿中除去大部分石蜡油，但不取出盖玻片，用一个尖镊子轻轻拈起盖玻片一角，在相对的一角中PCR反应混合液呈半月形液面，用移液器回收。一般可回收25μl混合液，将反应产物进行琼脂糖电泳或用套式PCR引物按标准PCR进行重新扩增。片上扩增物可做原位杂交显示。
在Slide-PCR中，需0.1%～1%的BSA。加入BSA可以保证扩增结果，但效率不一定很高。明胶（至少0.0001%）,对扩增1kb左右的靶DNA十分重要。但对小片段扩增结果影响不大。不同的样品提取方法或固定法对Slide-PCR都可行。
Silde-PCR的机理可能是在起始变性过程中一部分DNA从细胞中洗提出来，然后在细胞和玻片的水相中进行PCR。用地高辛标记的人全基因组DNA探针杂交表明在起始循环中DNA极微量，而30个循环后很丰富。常规细胞染色表明只有少量的形态改变。
Silde-PCR对于玻片上的细胞样品提供了一种较好的方法，而不必再把这些样品从玻片上括下来，使操作简便，污染减少。本方法对于原样品量极微且需病史追踪保存的（如子宫颈涂片或涂片）具有实用价值。

反转录PCR方法检测RNA
RNA的多聚酶链式反应（RT-PCR）是以RNA为模板，联合逆转录反应（reverse transcrip－tion, RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的特异DNA，为RNA病毒检测提供了方便；并为获得与扩增特定的RNA互补的cDNA提供了一条极为有利和有效的途径。RNA扩增包括两个步骤：①在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补链cDNA；②加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNA。
在RT-PCR中关键步骤是RNA的逆转录，cDNA的PCR与一般PCR条件一样。由于引物的高度选择性，细胞总RNA无需进行分级分离，即可直接用于RNA的PCR。但RT-PCR对RNA制品的要求极为严格，作为模板的RNA分子必须是完整的，并且不含DNA、蛋白质和其它杂质。RNA中即使含有极微量的DNA，经扩增后也会出现非特异性扩增；蛋白质未除净，与RNA结合后会影响逆转录和PCR；残存的RNase极易将膜板RNA降解掉。硫氰酸胍（GaSCN）-CsCl法或酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法可提得理想的RNA制品，尤以后者方法为佳，适合一般实验室进行。

常用的逆转录酶有两种，即禽类成髓细胞性白血病病毒（Avianmyeloblastosis virus, AMV）和莫洛尼鼠类白血病病毒（Moloney murineleukemia virus, MO-MLV）的逆转录酶（RT）。一般情况下用Mo-MLV-RT较多，但模板RNA的二级结构严重影响逆转录时，可改用AMV-RT ，因后者最适温度为72℃，高于Mo-MLV-RT的最适温度（37℃），而较高的反应温度有助于消除RNA的二级结构。
一步法扩增（one step amplification）是为了检测低丰度mRNA的表达，利用同一种缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP直接进行mRNA反转录与PCR扩增。发现Taq酶不仅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双重作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后的PCR扩增，从而使mRNA的PCR步骤更为简化，所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA。该法还可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cD－NA的克隆，并有可能与Taq酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在一个试管中进行。

定量PCR

1．DNA-PCR定量用同位素标记的探针与电泳分离后的PCR扩增产物进行杂交，根据放射自显影后底片曝光强弱可以对模板DNA进行定量。Abbot等利用这种方法对人类T细胞白血病反转录基因进行了定量研究。
PCR扩增产物用专为检测ds-DNA而设计的微量荧光计定量，利用染料H33258专与双链DNA结合而使荧光增强50倍的特性。可以从标准模板系列稀释扩增产物量曲线上读出样品中模板DNA的量或拷贝数，达到PCR定量的目的。
利用倍比稀释模板作系列稀释PCR，求出最低（PCR-EB）检测限来比较，也是常用的半定量PCR方法。

2．mRNA-PCR定量由于MRNA-PCR定量需经两个酶（RT和Taq）催化，因而影响因素较多。1989年Wang等报道了低丰度mRNA绝对定量方法。利用浓度已知且与待测靶mR-NA序列相同的内对照mRNA（其片段长短不同，便于PCR扩增后产物的分离），在同一体系中，用相同的由32P标记的引物与待测mRNA一同进行逆转录和PCR扩增，扩增产物电泳后，分别测定二者产物放射性强度，由预先制备的标准曲线推算出每个样本特异mRNA的量。Gilliland等的结果表明，在1ng总RNA中可以对小于1pg的特异mRNA进行定量。这一定量方法在肿瘤、代谢失调、基因表达调控等研究中均有重要意义。

由于PCR技术具有快速、简便、灵敏等特点，已被广泛地应用于临床医学、遗传咨询、司法鉴定、考古学及分子生物学等各个领域，有的替代了原有的方法，有的大大简化和方便了原有的方法。现将最常用的应用领域及研究方法介绍如下。
基因分析

PCR技术能够快速、灵敏地放大被测试的目的基因，所以可用于鉴定由于基因缺失、突变、转位及外源基因进入（如病毒感染）所引起的各种疾病。PCR技术已广泛地用于遗传病的基因分析、产前诊断、传染病病原体检测、癌基因临床分析等方面。PCR结合分子杂交等分析方法可进一步提高检测的灵敏度和准确性。
定位克隆

只要知道目的基因两端的序列，就可通过RT-PCR和重组PCR等技术进行基因克隆，这不仅省略了通常制备DNA片段的繁琐步骤，也避免了进行亚克隆的经典程序。
序列分析

PCR技术使DNA测序大为简化，因此现在几乎都采用PCR法进行序列测定。

除了上述三个方面的应用外，PCR还可用来制备高比活性标记探针，利用重组PCR可进行基因的人工定位突变和基因表达调控的研究。利用锚定PCR、反向PCR等还可对求知序列的基因进行分析。利用差示PCR、竞争PCR可进行DNA及mRNA的定量分析。法医学中应用PCR还可精确地选择出组织器官移植的合适配型。

2. 中医世家 http://www.zysj.com.cn/lilunshuji/shiyongmianyixibaoyuhesuan/969-25-4.html#m0-0