植物细胞

细胞是植物体结构和功能的基本单位。植物界的种类形形色色、千差万别，但就植物体的构造来说，除了低等的类型(病毒)以外，都是由细胞构成的。单细胞的低等植物，一个细胞就代表一个个体，一切生命活动，包括新陈代谢、生长、发育和繁殖，都由一个细胞来完成；复杂的高等植物，一个个体是由无数的细胞构成的，细胞之间有了机能上的分工和形态结构上的分化，它们相互依存、彼此协作，共同保证着整个有机体正常生活的进行。 ADFASDFAF23RQ23R

组成植物体的细胞的形状和大小是各不相同的，其不同部位的细胞，形状和大小与它们行使的功能密切相关。大多数高等植物细胞的直径通常约在10-200微米之间。植物细胞的大小差异很大，一般必须在显微镜下才能看到。在种子植物中，细胞的直径一般在10～100μm之间，较大细胞的直径也不过是100～200μm。也有少数植物的细胞较大，肉眼可以分辨出来，如番茄果肉、西瓜瓤的细胞，直径可达1mm；苎麻茎中的纤维细胞，最长可达550mm；有的细胞极长，如苎麻纤维细胞可长达55cm，最长的细胞是无节乳汁管，长达数米至数十米，如橡胶树的乳汁管，但这些细胞在横向直径上仍是很小的。植物细胞的大小是由遗传因素所控制，其中主要是由于细胞核的作用。 ADSFAEQWER353423413434

一般说来，具有同样功能的细胞，它们的大小可由下述因素所控制：①细胞核控制能力的限制。细胞核与细胞质一起进行着细胞中的生长、发育和保持细胞的正常代谢活动，细胞核对于细胞质的影响，在数量上有一定的限制，细胞的大小就受细胞核所能控制范围的制约。②细胞表面积的限制。生活细胞中，原生质不断地进行着一切代谢活动，并与周围环境(包括相邻的细胞)不断地进行物质交换；同时，进入细胞的物质，在内部也有一个扩散传递问题。细胞体积小，它的相对表面积就大，这对物质的迅速交换和转运都比较有利。此外，细胞的大小受细胞内代谢速率的影响。在自然界中，可以看到，代谢速率快的植物细胞一般都比较小，而较大的细胞活动相对较少。例如，根、茎顶端的分生组织细胞就比储藏的薄壁组织细胞要小得多。

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植物细胞的形状非常多样，常见的有球形、椭圆形、多面体、纺缍形和柱状体等。植物细胞的形状大小尽管多种多样，但基本结构是一样的。例如一切活细胞都含有原生质和其外面的细胞壁。坚硬的细胞壁保护着原生质体，并且维持着细胞的一定形状，其主要成分是纤维素。细胞壁是植物细胞独有的，动物细胞没有细胞壁。植物细胞还含有质体，是植物细胞生产和储存营养物质的场所。最常见的质体是叶绿体，它是专门进行光合作用的细胞器。动物细胞中不含有质体。大多数植物细胞都含有一个或几个液泡，液泡中充满了液体。液泡的主要作用是转运和储藏养分、水分和代谢副产物或代谢废物，即具有仓库和中转站的作用。除此外，植物细胞中还有线粒体、内质网、高尔基体、核糖体、圆球体、溶酶体、微管、微丝等细胞器。植物细胞中最重要的部分要数细胞核了，在光学显微镜下，细胞核可明显地分为核膜、核仁和核质三部分。核是遗传物质主要分布中心，同时也是遗传与代谢的控制中心。 ADSFAEQWER353423413434

人们都知道植物体是由细胞构成的，但这一结论的得出并非那么容易。340多年前，英国皇家科学学会的Robert Hooke用荷兰人Leeuwenhoek发明制作的显微镜观察了一小片软木，看到软木是由许多蜂窝状的小格子组成，Hooke将每一个格子称作“细胞”。

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1838～1839年，德国植物学家Matthias Schleiden（施莱登）和动物学家施旺根据对植物和动物观察的大量资料提出：一切动、植物有机体都由细胞组成；每个细胞是相对独立的单位，既有自己的生命，又与其他细胞共同组成整体生命。第一次明确地指出了细胞是有机体结构的基本单位，是生命活动的基本单位，从而建立了细胞学说(cell theory)。恩格斯高度评价了细胞学说，把它与能量守恒和转化定律、生物进化论并列为19世纪自然科学的三大发现。细胞学说为生物科学的发展奠定了坚实的基础。

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20世纪初，研制成电子显微镜，大大提高了显微镜的分辨率，从而使人们看到了光学显微镜下所看不到的更为精细的结构。20世纪60年代，利用组织培养技术，从植物离体细胞培养成完整的植株，这一事实表明了离体的单细胞具有遗传上的全能性。更进一步证明了细胞是生物体的结构和功能的基本单位，是生命活动的基本单位，也是生物个体发育和系统发育的基础。 ADSFAEQWER353423413434

细胞壁分为3个部分：

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• 1. 胞间层。
• 2. 初生壁。
• 3. 次生壁。

液泡（vacuole）：幼小的植物细胞（分生组织细胞）具有许多小而分散的液泡，在电子显微镜下才能看到。以后随着细胞的生长，液泡也长大，互相并合，最后在细胞中央形成一个大的中央液泡，它可占据细胞体积的90%以上。关于去掉植物细胞壁的纤维素酶和果胶酶的试剂。

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植物细胞与动物细胞的结构差异可用下表概括：

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植物细胞中还有线粒体、内质网、高尔基体、核糖体、圆球体、溶酶体、微管、微丝等细胞器。 ADSFAEQWER353423413434

要分离植物原生质体，必须去掉由果胶质、纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞壁。早期采用机械法，但产量低。Cocking发明的酶解法开创了大量分离原生质体的新技术，目前普遍采用酶分离法。 ADSFAEQWER353423413434

一般来说，植物各个器官，如：根、茎、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。但要获得高质量的原生质体，须选用生长旺盛、生命力强的组织。材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。

• 1. 细胞悬浮培养物：建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养愈伤组织。取用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无菌消毒后，在26℃黑暗条件下，在含2,4-D 2～4mg/L的MS固体培养基上诱导愈伤组织，每隔2～4d转接一次。选出增殖较快且呈颗粒状的愈伤组织，继代培养后转到液体培养基的100ml三角瓶中进行悬浮培养。用旋转式振荡器，速度控制在80～120r/min，在25±1℃下暗培养。悬浮培养初期每隔3d继代一次，一个半月后吸取4～5ml悬浮细胞转到250ml三角瓶的40ml新鲜培养中，以后每隔7d继代一次。通常经悬浮培养3～4月后，细胞大小变得较为一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生质体。
• 2. 叶肉细胞：是分离原生质体的最好细胞材料。取生理状态适宜的叶片，考虑光强3000～6000lx，温度20～25℃，相对湿度60%～80%。花粉四分体和花粉壁细胞也可用于分离原生质体。
• 3. 植物材料的预处理：能提高原生质体的分裂频率，逐步提高植物材料的渗透压以适应高渗环境。包括暗处理、预培养、低温处理等。豌豆枝条取下后，在黑暗湿度条件下放1～2d，存活率高并能分裂；羽衣甘蓝去掉下表皮再预培养7d；龙胆试管苗叶片需4℃低温处理才能分裂。

二、酶

• 1. 酶的种类：构成细胞壁的主要成分：纤维素（占干重25%～50%）、半纤维素（约53%）、果胶质（5%）。常用酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。纤维素酶从绿色木霉中提取，主要含纤维素酶C1（作用于天然纤维素）和Cx（作用于定形纤维素），还含纤维素二糖酶、木聚糖酶等。果胶酶从根霉中提取，降解果胶质。半纤维素酶降解半纤维素。还有蜗牛酶用于花粉母细胞和四分体细胞。ZA3～867纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉中提取的复合酶，含纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶等，分离效果较好。日本Onozuka纤维素酶常与果胶酶结合使用，采用二步法。
• 2. 渗透稳定剂：在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致与原生质体内相同或略大。常用糖溶液系统（甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等，浓度0.40～0.80mol/L）和盐溶液系统（KCl、MgSO4、KH2PO4等）。盐溶液系统可减少对材料生理状态的依赖，使酶活性更大。添加牛血清蛋白可减少细胞器破坏，葡聚糖硫酸钾可提高稳定性。
• 3. 酶溶液的pH值：对原生质体产量和生活力影响很大。例如菜豆叶片在pH5.0时产生快但损坏严重，pH6.0时数量增加，pH7.0时生活原生质体数量进一步增加，损伤减少。

三、原生质体的分离

采用“一步法”，即把一定量的纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料处理一次即可。每克材料用酶液10～30ml。需试验不同渗透压浓度，例如小麦悬浮细胞需0.55mol/L甘露醇，水稻只需0.4～0.45mol/L。去表皮叶片或直接切成小细条放入酶液中。酶解在黑暗中进行，偶尔摇晃。对于难以游离的材料，可置于摇床上低速振荡。酶解时间数小时至几十小时，一般不超过24h。温度一般25℃左右。若用叶片，取展开叶片，用0.53%次氯酸钠和70%酒精表面灭菌，切成2cm见方。4g叶组织置于200ml不加蔗糖和琼脂的培养基中，4℃黑暗培养16～24h，然后转入含纤维素酶、果胶酶、无机盐和缓冲液的混合液中（pH5.6，0.55～0.6mol甘露醇）。真空渗入后，在28℃、40r/min旋转式转床上培养4h。若用悬浮培养细胞，取悬浮细胞放入10ml酶液中（3%纤维素酶，14%蔗糖，pH5.0～6.0），25～33℃酶解24h。原生质体-酶混合液用30μm尼龙网过滤，低速离心收集。 ADSFAEQWER353423413434

四、影响原生质体分离的因素 ADFASDFAF23RQ23R

• 1. 酶制剂活力和纯度：粗制酶含核酸酶和蛋白酶等杂质，需纯化（如凝胶柱脱盐）。Onozuka纤维素酶R-10最适pH5～6，离析酶R-10最适pH4～5。实际常用pH4.7～6.0。
• 2. 渗透稳定剂的作用：糖溶液系统使原生质体再生细胞壁并分裂，但抑制多糖降解酶；盐溶液系统使原生质体稳定，酶活性大，但易形成假壁，分裂后细胞分散。

五、原生质体的净化和活力测定 ADFASDFAF23RQ23R

纯化常用过滤和离心相结合： ADFASDFAF23RQ23R

1. 原生质体混合液经筛孔40～100μm滤网过滤，除去未消化细胞团块等杂质。
2. 收集滤液，500r/min离心15min，吸取上清液。
3. 沉淀重新悬浮在洗液中（除不含酶外，其他成分同酶液），再次离心，重复三次。
4. 用培养基清洗一次，最后将原生质体密度调到10⁴～10⁶/ml进行培养。

活力测定常用FDA染色法：取洗涤过的原生质体悬浮液0.5ml，加入FDA溶液至终浓度0.01%，混匀，室温5min后荧光显微镜观察。激发滤光片QB24，压制滤光片JB8。发绿色荧光的为有活力，无荧光的无活力。叶肉原生质体发黄绿色荧光的有活力，发红色荧光（叶绿素）的无活力。

• 施莱登, 施旺. 细胞学说. 1838-1839.
• Cocking EC. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature, 1960, 187: 962-963.
• Robert Hooke. Micrographia. 1665.
• Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular Biology of the Cell. 6th ed. Garland Science, 2014.
• Buchanan BB, Gruissem W, Jones RL. Biochemistry and Molecular Biology of Plants. 2nd ed. Wiley, 2015.
• Davey MR, Anthony P, Power JB, et al. Plant protoplasts: status and prospects. Biotechnology Advances, 2005, 23(2): 131-171.