吗啉基
吗啉基（Morpholino）编辑本段
吗啉基与RNA混合形成的结构片段
吗啉代寡核苷酸（Morpholino Oligonucleotides） 是一类人工合成的核酸类似物，通过特异性结合靶标RNA（如mRNA或pre-mRNA）调控基因表达，广泛应用于基因功能研究、疾病模型构建及潜在治疗开发。是一种用来修饰基因表现的分子，吗啉基寡核苷酸是一种反义技术，可用来阻碍其他分子与特定核酸序列的结合。可阻挡RNA上约25个碱基的区域。此分子可应用在一些模式生物的研究上，包括小鼠(mice)、斑马鱼(zebrafish)、Xenopus（一类青蛙）等。
除了组合成寡核苷酸之外，吗啉基也可能出现在其他分子中。但“Morpholino”指其寡核苷酸形式，也就是磷酰二胺吗啉代寡核苷酸（phosphorodiamidate morpholino oligomers，PMO）。吗啉基是对天然核苷酸结构重新设计获得的合成分子。长度多为25个碱基，以标准核苷酸碱基配对的方式与RNA互补结合。在结构上来看，吗啉基与DNA的区别在于尽管前者有标准的核苷酸碱基，这些碱基却连接在吗啉环上，而非脱氧核糖环。吗啉通过占据体内mRNA与其它分子作用位点来发生作用。
合成MORPHOLINO的公司编辑本段
GENE TOOLS公司成立于1997年，位于AVI Biopharma公司旗下，是一家生产生物学和医学研究所需的序列个性化的Morpholino oligos的生物技术公司。其Morpholino产品从2000年开始商业化，目前已经有1700篇研究型论文涉及到Morpholino。
GENE TOOLS的初级产品Morpholino反义核苷酸，是合成分子，阻断特定基因活性的Morpholino。Morpholino的亚单位的连接顺序决定了受其阻断的目的基因。GENE TOOLS公司根据客户需要，设计关闭目的基因活性的个性化Morpholino。GENE TOOLS公司通常每周能够合成200多个Morpholino。
GENE TOOLS的客户一般是大学、研究所和制药公司的研究人员。
发育生物学家通过将 Morpholino oligos注入卵子或者斑马鱼、青蛙、海鞘、海胆等的受精卵中研究胚胎发育
细胞生物学家利用Morpholino oligos研究新经过测序的基因的功能
医疗工作者利用Morpholino oligos研究癌症等疾病的细胞学机制
1. 吗啉代的结构与化学特性
基本组成：
吗啉环：替代天然核酸中的核糖/脱氧核糖，形成六元吗啉环结构（含一个氧和氮原子）。
磷酸二酰胺键：连接吗啉环，替代天然磷酸二酯键，增强抗核酸酶降解能力。
碱基配对：保留A、T、C、G碱基，通过Watson-Crick配对与靶RNA结合。
化学稳定性：
对核酸酶（如RNase、DNase）高度耐受，半衰期长达数天至数周。
无电荷，需依赖物理方法（显微注射、电穿孔）或载体（如Endo-Porter）递送入细胞。
2. 作用机制
(1) 基因表达抑制
翻译阻断：结合mRNA的5'UTR或起始密码子区域，阻止核糖体组装，抑制蛋白质合成。
剪接调控：靶向pre-mRNA的剪接位点（如外显子-内含子交界区），诱导外显子跳跃或保留，改变成熟mRNA结构。
(2) miRNA抑制
结合microRNA（miRNA）或miRNA结合位点，阻断miRNA与靶mRNA的相互作用（即“miRNA sponge”功能）。
3. 应用领域
(1) 基础研究
基因功能解析：在模式生物（斑马鱼、非洲爪蟾胚胎）中快速敲低基因，研究发育表型。
可变剪接研究：设计剪接调控型吗啉代，生成特定剪接异构体（如Duchenne肌营养不良模型中跳过突变外显子）。
(2) 疾病模型构建
急性基因沉默：模拟遗传病突变效应（如心血管疾病、神经退行性疾病）。
病毒复制抑制：靶向病毒RNA关键区域（如登革热病毒基因组保守区）。
(3) 治疗探索
反义疗法：临床试验中用于杜氏肌营养不良（如Eteplirsen，跳过DMD基因第51号外显子）。
抗感染：抑制病原体关键基因（如结核杆菌耐药基因）。
4. 实验设计与优化
(1) 靶标选择
序列特异性：设计20-25个碱基，避免自身互补或重复序列，使用软件（如Gene Tools）预测特异性。
结合位点：
翻译阻断：靶向mRNA起始密码子附近（如-25至+25区域）。
剪接调控：覆盖剪接供体/受体位点或外显子剪接增强子。
(2) 递送方法
显微注射：斑马鱼胚胎、蛙卵等模式生物的直接注射（浓度通常为0.1-1 mM）。
电穿孔：适用于体外培养细胞或组织（如小鼠视网膜）。
载体辅助：
Endo-Porter：通过内吞作用将吗啉代递送入胞质。
纳米颗粒：提高体内递送效率（如脂质体包裹）。
(3) 对照设计
标准阴性对照：随机序列吗啉代（无已知靶标）。
表型拯救实验：共注射靶标mRNA（无吗啉代结合位点）验证特异性。
5. 优缺点分析
| 优势 | 局限性 |
|---|---|
| 高特异性与稳定性（无RNase H激活） | 需物理递送，体内应用受限 |
| 快速起效（数小时内抑制蛋白表达） | 脱靶效应（高浓度时可能结合相似序列） |
| 适用于胚胎/活体研究（低毒性） | 瞬时效应（通常维持3-5天） |
| 可逆性（代谢后功能恢复） | 设计不当可能导致非预期剪接 |
6. 与其他基因沉默技术的对比
| 技术 | 作用机制 | 持续时间 | 递送难度 | 应用场景 |
|---|---|---|---|---|
| 吗啉代 | 阻断翻译/剪接（不降解RNA） | 数天至数周 | 高 | 胚胎、急性实验 |
| siRNA | RNAi介导mRNA降解 | 数天 | 中 | 细胞系、部分体内模型 |
| CRISPR/Cas9 | DNA水平敲除或编辑 | 永久 | 高 | 遗传修饰、长期效应研究 |
| shRNA | 稳定整合基因组，持续RNAi | 长期 | 中 | 转基因动物、细胞系 |
7. 注意事项与挑战
脱靶效应：通过生物信息学筛选及多吗啉代交叉验证减少假阳性。
剂量优化：过高浓度可能导致非特异性毒性（如细胞死亡或发育异常）。
体内递送：开发新型递送系统（如肽偶联吗啉代）以提升组织靶向性。
8. 研究前沿
共价吗啉代：通过光交联技术固定靶RNA-吗啉代复合物，用于结构解析。
多功能偶联：结合荧光标记（如FITC）实时追踪吗啉代分布。
临床转化：优化吗啉代化学修饰（如vivo-morpholino）延长体内半衰期。
总结
吗啉代寡核苷酸凭借其高稳定性、可逆性及精准的基因调控能力，成为发育生物学与疾病机制研究的利器。尽管递送挑战限制了其临床应用，但通过化学修饰与新型载体开发，其在反义治疗与个性化医疗中的潜力正逐步释放。实验成功的关键在于严谨的靶标设计、递送方法优化及多重对照验证。
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