ELISA
ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)是一种广泛应用的免疫学检测技术,用于定量检测抗原或抗体。ELISA具有高灵敏度、高特异性和易操作等优点,常用于生物医学研究、临床诊断和药物开发。以下是关于ELISA的详细信息:
### 1. 基本原理
ELISA利用抗原-抗体特异性结合的原理,通过酶标记的二抗与底物反应生成有色产物,从而实现对目标抗原或抗体的检测和定量。
### 2. ELISA类型
1. **直接ELISA(Direct ELISA)**
- **步骤**:
1. 将抗原直接包被在微孔板上。
2. 加入酶标记的一抗,结合抗原。
3. 加入底物,酶催化反应生成有色产物。
4. 通过比色法测定吸光度。
- **优点**:操作简便,步骤少。
- **缺点**:灵敏度较低,特异性依赖于一抗的质量。
2. **间接ELISA(Indirect ELISA)**
- **步骤**:
1. 将抗原包被在微孔板上。
2. 加入一抗(未标记),结合抗原。
3. 加入酶标记的二抗,结合一抗。
4. 加入底物,酶催化反应生成有色产物。
5. 通过比色法测定吸光度。
- **优点**:灵敏度较高,二抗易获得。
- **缺点**:步骤较多,可能有非特异性结合。
3. **夹心ELISA(Sandwich ELISA)**
- **步骤**:
1. 将捕获抗体包被在微孔板上。
2. 加入待测抗原,结合捕获抗体。
3. 加入检测抗体,结合抗原的另一表位。
4. 加入酶标记的二抗,结合检测抗体。
5. 加入底物,酶催化反应生成有色产物。
6. 通过比色法测定吸光度。
- **优点**:特异性高,适用于大分子和复杂样品。
- **缺点**:需要两种特异性抗体。
4. **竞争ELISA(Competitive ELISA)**
- **步骤**:
1. 将抗原包被在微孔板上。
2. 加入样品中的抗原和酶标记的抗原,竞争性结合抗体。
3. 洗涤去除未结合的抗原。
4. 加入底物,酶催化反应生成有色产物。
5. 通过比色法测定吸光度。
- **优点**:适用于小分子抗原和低浓度样品。
- **缺点**:操作复杂,灵敏度依赖于竞争效应。
### 3. 实验步骤(以间接ELISA为例)
1. **板包被**:将目标抗原稀释后加入96孔板中,4°C过夜孵育,抗原吸附在板上。
2. **封闭**:加入封闭液(如BSA、奶粉溶液),37°C孵育1-2小时,封闭未结合的孔壁。
3. **加样**:加入一抗,37°C孵育1-2小时。
4. **洗涤**:使用洗涤液(如PBS-T)多次洗涤,去除未结合的一抗。
5. **加酶标记二抗**:加入酶标记的二抗(如HRP标记的抗IgG抗体),37°C孵育1小时。
6. **洗涤**:再次洗涤,去除未结合的二抗。
7. **加底物显色**:加入底物溶液(如TMB),室温孵育,酶催化反应生成有色产物。
8. **终止反应**:加入终止液(如硫酸),停止酶反应。
9. **读数**:在酶标仪上测定吸光度(通常在450 nm)。
### 4. 数据分析
- **标准曲线**:使用已知浓度的标准品进行实验,绘制标准曲线,通过比色法测定的吸光度值计算样品中抗原或抗体的浓度。
- **比色法**:通过比色法测定吸光度,反映样品中目标物质的含量。
### 5. 应用
- **临床诊断**:检测血液、尿液、唾液等样品中的抗原或抗体,用于疾病诊断(如感染性疾病、免疫疾病)。
- **科研研究**:研究蛋白质的表达、相互作用和功能。
- **食品安全**:检测食品中的有害物质(如毒素、农药残留)。
- **药物开发**:评估药物的免疫反应和药效学特性。
### 6. 优势与局限性
- **优势**:
- 高灵敏度和高特异性。
- 操作相对简便,适合高通量筛选。
- 可用于多种类型的样品。
- **局限性**:
- 需要高质量的抗体。
- 可能存在非特异性结合,需要严格的实验控制。
- 需要优化实验条件,确保结果准确。
### 参考文献
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