神经元培养

神经元培养是一种重要的实验技术，用于研究神经元的发育、功能、信号传导和疾病机制。以下是关于神经元培养的详细信息，包括实验准备、培养步骤、注意事项和应用。

### 1. 实验准备

#### 材料和试剂

- **培养基**：神经元培养基（如Neurobasal培养基）、胎牛血清（FBS）、N-2或B-27补充剂、谷氨酰胺、抗生素（如青霉素/链霉素）。

- **酶解试剂**：胰蛋白酶（Trypsin）或胰蛋白酶替代品（如TrypLE）。

- **培养器皿**：培养皿、培养瓶、玻片等。

- **涂层试剂**：聚-D-赖氨酸（Poly-D-lysine）、层粘连蛋白（Laminin）等。

#### 设备

- **无菌操作台**：用于无菌操作。

- **CO2培养箱**：37°C，5% CO2，95%湿度。

- **倒置显微镜**：观察细胞形态和生长情况。

- **离心机**：用于细胞离心和洗涤。

### 2. 神经元的获取

#### 胚胎神经元

1. **胚胎取材**：从妊娠14-16天的小鼠或大鼠胚胎中获取脑组织。

2. **脑组织分离**：在无菌条件下，使用解剖工具分离脑皮层或海马组织。

3. **组织消化**：将分离的脑组织置于含有胰蛋白酶的消化液中，37°C消化10-20分钟。

4. **酶抑制**：加入含有血清的培养基终止酶解反应。

5. **机械分离**：用细口移液器轻轻吹打，分离成单细胞悬液。

#### 成体神经元

1. **脑组织取材**：从成年小鼠或大鼠中获取特定脑区域的组织。

2. **组织切片**：将脑组织切成薄片（300-400 µm）。

3. **消化和机械分离**：使用酶和机械方法分离成单细胞悬液。

### 3. 细胞培养

#### 涂层准备

1. **培养皿涂层**：在培养皿或玻片上涂覆聚-D-赖氨酸（0.1 mg/ml）或层粘连蛋白（5-10 µg/ml），室温孵育2小时或4°C过夜。

2. **洗涤**：用无菌水或PBS洗涤培养皿，去除未结合的涂层试剂。

#### 细胞接种

1. **细胞计数**：用细胞计数器计数细胞数量，调整细胞浓度。

2. **细胞接种**：将单细胞悬液接种到涂层好的培养皿中，通常接种密度为1-5 × 10⁵ cells/ml。

3. **培养基添加**：加入适量的神经元培养基，确保细胞浸没。

#### 细胞培养

1. **初始培养**：将培养皿放入CO2培养箱中，37°C，5% CO2孵育。

2. **培养基更换**：培养24小时后更换培养基，去除悬浮细胞和碎片。此后每2-3天更换一次培养基。

### 4. 注意事项

- **无菌操作**：确保操作过程无菌，防止细胞污染。

- **培养基选择**：使用适合神经元生长的培养基，如Neurobasal培养基加N-2或B-27补充剂。

- **细胞密度**：适当的细胞密度有助于神经元的附着和生长。

- **温度和CO2控制**：培养条件应保持在37°C和5% CO2。

### 5. 应用

- **神经元功能研究**：研究神经元的电生理特性、突触传递和神经可塑性。

- **药物筛选**：测试药物对神经元生长、存活和功能的影响。

- **疾病模型**：建立神经退行性疾病、神经损伤和神经炎症等体外模型。

- **基因功能研究**：通过基因编辑、RNA干扰等技术研究基因在神经元中的功能。

### 6. 实验示例

- **突触形成观察**：在培养的神经元上，通过免疫荧光染色观察突触前和突触后标志物的表达，研究突触形成和发育。

- **电生理记录**：使用膜片钳技术记录培养神经元的膜电位变化和突触传递活动。

- **药物处理实验**：在培养的神经元中加入不同浓度的药物，观察药物对神经元存活、形态和功能的影响。

### 参考文献

1. **Brewer, G. J., & Torricelli, J. R. (2007)**. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols, 2(6), 1490-1498.

2. **Kaech, S., & Banker, G. (2006)**. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols, 1(5), 2406-2415.

3. **Goslin, K., Asmussen, H., & Banker, G. (1998)**. Rat hippocampal neurons in low-density culture. In Culturing Nerve Cells (pp. 339-370). MIT Press.

4. **Beaudoin, G. M. J., Lee, S.-H., Singh, D., Yuan, Y., Ng, Y.-G., Reichardt, L. F., & Arikkath, J. (2012)**. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nature Protocols, 7(9), 1741-1754.

5. **Dotti, C. G., Sullivan, C. A., & Banker, G. A. (1988)**. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience, 8(4), 1454-1468.